“茚三酮法”的版本间的差异

2016年9月23日 (五) 17:22的最新版本

1. 原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生 CO2 、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。但也有些物质对茚三酮也呈类似的阳性反应，如β-丙氨酸、氨和许多一级胺化合物等。所以定性或定量测定中，应严防干扰物存在。
2. 试液的配制：KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。 乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量

茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。

从原理上就可以看出还原型茚三酮是反应过程中生成的，所以我想也就不必非要在配液时候用还原型茚三酮了，而且还原型茚三酮在常态下能否稳定存在还是个问题，也就是说你不一定能找到还原型的茚三酮试剂。 关于显色剂的不同浓度我想可能是考虑了紫外检测器的置信区间，即0.3-0.7范围内的数值比较准确，你配制的显色剂与反应液作用后吸光度应该在此范围内，否则应该降低显色剂的浓度，以使吸光度落在紫外置信区间内。