酵母扩培

获得合适的酵母细胞

纯种培养要选用经过实践证明合格可靠的酵母细胞。酵母细胞的分离在高泡阶段完成。根据单细胞分离法（即小滴培养法）在显微镜下以小滴形式分离出单个酵母细胞，将许多这样的单个酵母细胞在8~10℃与主酵温度相吻合的情况下进行繁殖培养。接下来可以在显微镜下追踪观察酵母细胞不同阶段的生长情况，并据此对酵母细胞进行挑选。借助无菌滤纸条吸取其中最健壮的酵母菌落，并把它置于5ml无菌麦汁中开始培养，然后逐级扩大培养，最高稀释比例可达1:10.若酵母不立即使用，则可将酵母细胞保存在0~5℃的麦汁琼脂（固体培养基）的斜面培养基上，并注入液体石蜡以防止培养基变干。如此处理后的样品可保存6~9个月（酵母银行）。

实验室扩培

啤酒厂获得接种酵母的方式有三种途径，分别是直接购买酵母泥、购买纯种酵母菌种以及自己保存并扩培酵母。其优缺点见下图

	购买酵母泥	购买纯种酵母	自己保存和培养酵母
优点	无酵母管理工作、无酵母扩培设备	方法可行、可靠性高、能得到灭菌的酵母	取用灵活、酵母质量可靠、啤酒质量稳定
缺点	有污染危险、费用高、啤酒质量不稳定	需要酵母扩培装置，费用高	一次性投资大、无菌程度要求高

酵母的纯种培养分为三个阶段：获得合适的酵母细胞；实验室扩培，直至达到5~10L高泡嫩啤酒；车间扩培，直至达到接种所需添加量。

酵母扩培过程的目的是在最短时间内、无菌环境中培养出具有特定代谢产物，能够适合正常发酵并酿制出优质啤酒的接种酵母。因此，正确处理酵母，合理控制扩培过程十分重要。

酵母繁殖过程必须有三个条件得到满足：氧气、氨基酸以及微量元素的供给。

• 氧气供给

供氧是保证酵母繁殖的重要前提条件。有氧情况下进行的呼吸大写会调动酵母细胞激活其新陈代谢活动并生成新细胞所需结构物质。但麦汁中的高糖含量却会限制呼吸作用，而使酵母开始发酵过程。因此无法达到采用更强烈的通风来无限制地提高酵母反质量的目的。开始形成新细胞后，细胞膜脂双层所必需的主要成分磷脂不断被储存起来。氧气使一部分脂肪酸转变为熔点更低的不饱和脂肪酸，因此能够进一步提高细胞膜的物质通透性能。合成硬脂酸甘油酯时同样需要氧气参与。硬脂酸甘油酯的合成过程与酵母繁殖直接相关，另外也与酵母体内储备糖原的过程密切联系在一起。脂质和酯的生成过程相对立，只要脂质仍在生成（有氧供给时），酵母就不会合成酯类物质。

• 氨基酸和微量元素的供给

麦汁中所含有的氨基酸和矿物质足够满足酵母发酵所需。但如果希望酵母进行繁殖，就需要更多的氨基酸和矿物质，而这一点往往无法达到。因此即使通风供氧再强烈，酵母细胞能够达到的最高细胞浓度也只能在每毫升100百万左右。主要受到限制的因素是麦汁中仅含有200~240mg/L氨基酸，而且并不是这些氨基酸都能被酵母所同化（比如脯氨酸）。

对接种所用麦汁的要求如下：碘检颜色正常；满足所需生产啤酒典型的颜色和外观要求；氧含量至少含有8~10mg/L；游离氨基酸含量至少应该再200~230mg/L；锌离子含量至少在0.15mg/L；黏度最高不能超过1.7mPa·s（以10°P麦汁计）；ph在5.0~5.2；不能存在任何污染物。

对接种酵母的要求：接种酵母必须通过纯种培养方式获得，能够保证达到所需生产啤酒典型的风味。另外还必须满足以下条件：具有高活力；不能带有异类酵母或污染物；死亡细胞比例不能超过3%；外观需呈浓稠泥装。

常见扩培容积与接种麦汁量

容器代号	1	2	3	4
容器体积/ml	35	250	1000	5000
无菌麦汁量/ml	10	100	300	1800
接种量/ml	-	20	120	420
总量/ml	10	120	420	2220

实验室扩培的顺序

斜面试管（原菌种） → 富氏瓶（或试管培养） → 巴氏瓶（或三角瓶培养） → 卡式罐

斜面试管培养

以上面酵母为例，将一支斜面保存的试管菌种及装液量为10ml的两支液体培养基试管调整至相同温度（25℃~28℃），然后将其外部用75%酒精杀菌，在无菌接种室超净工作台上，进行移植培养工作。先将种酵母斜面试管上部和棉塞用酒精灯火焰杀菌。接种前手和所用的工具用75%酒精杀菌，做好消毒准备工作。而后用已杀菌的接种针挑取菌种，迅速接种到试管内，即刻将棉塞塞牢，稍加震荡，放在25℃~28℃的保温箱中培养，两支液体试管操作相同。培养8~12h左右，见起泡、试管底部出现白色沉淀物，即为酵母菌体。在培养过程中，每隔2h要加以震荡，不仅可以使沉淀的酵母重新分布到培养基中，促进发酵，而且能促进溶氧，。观察其发酵情况，如泡沫升起的多少和粗细程度，酵母沉淀的多少和坚实与否，以判定酵母优劣和发酵情况。发酵结束后，将两只发酵好的液体试管在无菌接种室超净工作台上全部倾倒入装液量为100ml液体培养基的250ml三角瓶中，同样要注意事先消毒和无菌操作。以后步骤相同，逐级扩大培养。直至5000ml三角瓶。根据生产能力可以平行做几组，以供生产发酵使用。

富氏培养或小三角瓶

富氏（Freudenreich）培养是利用富氏瓶加以扩大培养的。富氏瓶内装麦芽汁10ml，瓶颈部磨砂口玻璃罩上部细管用棉花塞住，经过严密的杀菌后备用。

将斜面保存的试管菌种及富氏瓶外部用酒精杀菌，在无菌接种室超净工作台上进行移植培养工作。先将酵母斜面试管上部和棉塞用酒精灯火焰杀菌，而后用已杀菌的白金针挑取菌种，迅速地接种到瓶内，即刻将瓶罩盖牢，稍加震荡，放在25℃~37℃的保温箱中培养。

在保温箱中培养的时间为8~12h，如果酵母强装，经过8~12h后即可移植到巴氏瓶；如果酵母发酵力弱，可适当延长时间。同一种酵母每次培养2~4瓶，以便扩大培养时加以选择。不论在何种情况下不应等待发酵完了后再接种，最好掌握在发酵液稍有浑浊现象而大部分酵母已经沉淀时移种到巴氏瓶中。

富氏瓶为圆形玻璃瓶，瓶小而高，容易倾倒，使用不方便，目前，啤酒厂多数采用20ml试管代替。为使酵母强装，可以重复液体试管培养两三次。

巴氏培养

巴氏培养是利用巴斯德培养瓶进行微生物培养，巴氏瓶为圆底具有曲颈长管和侧管的玻璃瓶。长管的第一弯曲和第二弯曲处有一膨大部分，以免麦芽汁在煮沸杀菌后，冷却时将产生的气泡吸入到培养瓶内，以防止杂菌混入培养液中。侧管在长管的反方向，其上附有橡皮管和短玻璃棒，侧管是培养液和种酵母的加入口，也是培养发酵液和酵母移入卡式培养管或汉生培养罐的出口。

瓶子的容量有125ml、250ml、500ml和1000ml四种。一般取500~1000ml的巴氏瓶，将其刷洗干净，在干燥箱中烘干，将曲颈长管用小棉花塞堵住，侧管接上橡皮管。而后将准备好的麦芽汁用小漏斗从侧管加入250~500ml，将巴氏瓶放在电炉上加热煮沸，使瓶内蒸汽从侧管喷出，20分钟后，用玻璃棒将侧管胶皮管堵住、捆牢，再继续加热10~15分钟，蒸汽由曲颈长管的棉塞处溢出。煮沸杀菌约半小时，而后将瓶取下放冷，停放2~3天，使之吸收部分氧气，再进行接种。如果培养液浓度较低，在煮沸20分钟后浓度即达到预定的要求，便不必再追加蒸馏水；如果培养液事先已经调整到所要求的浓度，经过煮沸后，必须追加蒸馏水，然后继续加热煮沸10~15分钟至恰好达到所要求浓度。

在无菌室内，将巴氏瓶侧管和胶皮管、富氏瓶（或试管）及所用的工具和收，用75%酒精杀菌。移种时，先将富氏瓶中沉淀到底部的酵母震旦起来，使之与培养液混合均匀，再将瓶上的玻璃罩取下（或将是观赏的棉塞拔下来），用事先经过干热杀菌的10ml移液管吸取酵母菌悬液，同时将巴氏瓶侧管上的玻璃塞拔下，把吸夜观吸取的酵母菌悬液注入巴氏瓶中，即刻将玻璃塞于酒精灯上杀菌后堵住胶皮管，或捆扎以防脱出。

将移植后的巴氏瓶放在25℃保温箱中培养2天，每天加以摇动并检查培养情况。用巴氏瓶培养时，为了使酵母能逐渐适应低温环境，可使用较低的温度，将保温培养箱温度调节到20℃左右，或利用20℃上下的室温进行培养，但培养时间要略长一些。

利用巴氏瓶培养酵母时，为了使培养有把握，可利用同一种酵母做两个平行的巴氏瓶培养，以备扩大培养时选择使用。

巴氏瓶也可用大三角瓶或平底烧瓶代替。巴氏瓶或三角瓶等的消毒杀菌，大都在消毒杀菌釜内进行，保持0.05MPa气压杀菌半小时即可。

车间酵母扩培

车间继续进行的酵母扩培可以在下述设备中进行：酵母扩培设备、开放式扩培容器。

扩培过程中每一个酵母细胞均必须形成自身质量几倍的新细胞，扩培结束时，纯种酵母细胞的浓度可达到100~140百万个/ml。为了完成如此艰巨的任务，酵母除需要麦汁中拥有足够的营养成分外，还特别需要氧气，这是因为：

• 形成有机化合物需要能量。
• 酵母主要通过有氧呼吸获取增殖所需的能量，无氧发酵时收获的能量远远不够。
• 酵母的呼吸代谢过程必需氧的参与。而高糖含量会组织呼吸过程，所以无限制地提高供氧量也没有意义。
• 所供氧气必须分配良好，能够让每一个细胞都得到供给。
• 实际生产中必须通入过量的氧，但是没有溶解、快速溢出的氧气是无法通过渗透作用来给细胞供氧的，而且只会带来不必要的泡沫问题。

酵母扩培设备与操作过程

酵母扩培设备由不同规格的密闭不锈钢罐组成。在这些罐中所进行的扩大培养直至达到发酵池或发酵罐接种所需的酵母添加量为止。扩培方法有多种。

酵母扩培设备由一个麦汁灭菌罐和一个增殖罐组成。麦汁灭菌罐负责对待发酵的麦汁进行灭菌并加以冷却。而酵母增殖以逐级扩大的方式在不同大小的增殖罐中进行，直到拥有锥罐所需的接种量。

以下几点对酵母纯种培养很重要：

• 进入增殖罐以前，一切工作都必须在无菌条件下进行。否则以后根本无法去除这些污染微生物，因为它们的生存条件大多与酵母一样。
• 强烈通入无菌空气是酵母迅速生长的前提，只有这样才能培养出健壮且发酵力强的酵母。
• 在20~25℃时，酵母繁殖速度要比低温时快。但酵母培养温度要逐步下降到车间所选用温度，以便在生产中达到完全的发酵能力。
• 纯种培养要选用打出麦汁，因为其中的酒花苦味物质有抑制杂菌污染的作用。

操作过程如下：

• 将麦汁装入灭菌罐中，在100℃下灭菌至少30分钟以杀死所有微生物。灭菌后，将麦汁冷却至14~16℃。
• 将酵母加入酵母增殖罐中。若增殖罐有各种规格，则首先在无菌条件下将卡式罐中的酵母添加到最小的增殖罐中。倒罐时首先必须将取样阀处的两个开口用火焰灭菌，以避免污染。为使酵母加快增殖，麦汁必须强烈而通风。为此需将麦汁从灭菌罐中泵入增殖罐，达到酵母罐所需的容积后，再对酵母罐进行外体循环并同时通风。容积这两利用压力传感器来完成。
• 大约一天以后（24~36小时），培养液达到高泡期（对数生长期）。此时，需在无菌条件下，将培养液泵入下一个更大的、装有无菌麦汁的增殖罐中。该过程一直重复进行至达到所需的酵母量为止。
• 当增殖罐中达到最高酵母量时，将此时正处于高泡期的嫩啤酒泵入发酵罐中。为确保最佳的发酵过程，需要在倒罐时再次进行强烈通风。

增殖罐中药保留一定量的处于高泡期的残液。立即加入无菌麦汁后又可以开始下一次酵母增殖过程。清晰增殖罐之前，必须完全排空增殖罐。

采用该追加式扩培方法能够在实际生产条件下、在较短时间间隔内连续进行纯种扩培，由此达到均匀的酵母质量。

所有啤酒厂都要尽可能使每次接种时的酵母处于最佳状态。众所周知，使用对数生长期的酵母来发酵具有许多优点，如，起发快，发酵时间短，ph下降快，双乙酰还原快且完全，啤酒口味纯正、圆润。

根据扩培时的不同接种方式又可将扩培工艺划分为两大类：

• 将一部分处于高泡期的培养液在接种结束后保留在增殖罐中，加入新麦汁后又可重新开始增殖过程。该工艺被称为同化工艺。
• 或者再从头开始纯种培养过程，这意味着增殖罐最后被完全排空。该工艺被称为一罐法。