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啤酒生产中常见病害微生物及其特征
为了把污染的风险降至最小，我们应该定期取样检查，以确定在某个环节是否感染，如果感染可以立即采取措施，并且善于总结经验，有助于提高。
杂菌的来源与主要污染途径
杂菌的来源
- 空气
- 啤酒生产过程中，目前传统方法大都是开放操作，物料经常与空气直接接触，如果空气不干净，容易染菌。扩培中的酵母由于自酿的设备极其简陋，有可能只是一个三角瓶配合棉花，这时候如果环境中的空气不干净，则很容易污染扩培中的酵母。又如，在麦汁冷却后需要通入氧气以供酵母呼吸，如果通入的空气不干净，是极为容易染菌的。因此，环境卫生和无菌供氧是非常重要的。
- 水
- 由于生产中用水几乎在每个环节，尤其是在酵母活化和扩培的环节的用水，直接影响到酵母的健康，所以水的无菌处理是非常重要的。
- 原料
- 原料会带入一部分杂菌，但是在煮沸环节中，这些杂菌几乎已经被杀灭（干投、直接添加等除外），所以原料中的杂菌并不是十分危险。
- 设备和管路
- 直接与麦汁接触的设备和管路如果不干净，极易染菌，尤其是看不见的部分（如阀门、弯头）更要彻底灭菌。
主要污染途径
啤酒有害菌的划分与分类
按生理学类型分类
啤酒厂的病害生物，主要包括下列三方面：细菌、野生酵母和霉菌。
- 严格需氧菌
- 它在生长过程中，必须有氧的存在，否则不能声张。霉菌是典型的需氧菌。
- 微需氧菌
- 它在微量含氧情况下能生存。醋酸杆菌和醋酸单胞菌属于此类。
- 兼性厌氧菌
- 在有氧或无氧环境下都能生存，酵母属于此类。
- 绝对厌氧菌
- 在有氧环境下不能生存，如短螺状菌、啤酒巨型球菌。
啤酒厂的病害生物，主要是各种野生酵母和某些属的细菌。它们均属于微需氧菌和兼性厌氧菌。霉菌和放线菌在麦汁（酸性）和啤酒（厌氧）的条件下很难生长繁殖。但是啤酒的生产环境却经常污染霉菌，应该引起足够的重视。
按对啤酒的有害程度分类
可以把啤酒有害菌分为五个等级，它们能够对啤酒的口味和气味产生损害，或通过形成浑浊、沉淀使啤酒外观发生变化。
- 专性啤酒有害菌
- 对啤酒质量稳定性的影响最大，它们在啤酒低温、厌氧、低PH值、含有酒花苦味物质和酒精以及缺乏营养物质的不利环境下，仍然能很好地生长，并且不需要较长的适应期。
- 潜在啤酒有害菌
- 只有在一定的条件下，潜在啤酒有害菌才能在啤酒中生长并造成危害，如啤酒PH值偏高、酒花的苦味物质太低、发酵度不高、含氧量高、酒精含量较低。某些微生物经过较长的适应期后才会表现出啤酒有害菌的特征，它们也属于潜在啤酒有害菌。生产中要注意这类微生物，采取措施控制其数量，不允许它们在生产中长时间存在。否则，它们会逐渐适应啤酒的特殊环境。
- 间接啤酒有害菌
- 一般出现在酵母接种和发酵的起始阶段，对啤酒不会产生直接损害。但是在一定条件下，它们仍能在啤酒生产过程中繁殖，产生影响啤酒口味的前驱物质，并最终对成品啤酒的质量造成不良影响。
- 指示性微生物
- 虽然它们对啤酒的生物稳定性不会产生危害，但当它们出现时，往往会伴随着啤酒有害菌的出现，其特点是比较容易被检查出来。当清洗和灭菌措施有缺陷，或者当生产过程出现问题时，指示性微生物就会出现。按照实际经验，如果指示性微生物一旦出现，应该迅速采取相应措施，防止微生物状况继续恶化。
- 潜伏微生物
- 这些微生物只是偶然和无规律地出现，通过不同的途径侵入生产过程直至成品啤酒中。该类微生物造成的染菌，持续时间是短暂的，染菌的主要原因是由于生产用水染菌以及现场进行建筑维修等。它们通常是自然界广泛存在的微生物，在食品生产企业导出能发现。与其他微生物相比，区别在于其强壮的菌体细胞能在啤酒中存活，用一般传统培养方法就可以把它们检查出来。
| 啤酒有害菌等级 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 等级 | 能否在啤酒中生长 | 经适应后能否在啤酒中生长 | 能否在抑菌能力降低的啤酒中生长 | 能否在非专门培养基中检测到（如麦汁培琼脂养基） | 举例 | 对啤酒的影响及作用 |
| 专性啤酒有害菌 | 能 | 能 | 能 | 不能/能 | 乳酸杆菌 四联球菌 果胶杆菌 酿酒酵母 |
浑浊/酸败 沉淀/双乙酰过高 浑浊/丙酸、乙偶姻过高 沉淀/浑浊 |
| 潜在啤酒有害菌 | 不能 | 能/不能 | 能/不能 | 能/不能 | 乳酸杆菌 链球菌 微球菌 发酵单胞菌 巴氏酵母 |
轻度浑浊/双乙酰过高 轻度浑浊/双乙酰过高 异香/轻微沉淀 浑浊/H2S/DMS/乙醛口味缺陷 口味变化/浑浊 |
| 间接啤酒有害菌 | 不能 | 不能 | 不能/能 | 能 | 肠杆菌 变形杆菌 假丝酵母 汉逊酵母 酿酒酵母 |
苯酚味/DMS/乙偶姻/蛋白酶 苯酚味/DMS/蛋白酶 口味缺陷（挥发性苯酚味） 口味缺陷（乙酸乙酯） 造成发酵缺陷 |
| 指示性微生物 | 不能 | 不能 | 不能 | 能 | 醋酸杆菌 不动细菌 克莱伯氏菌 德巴利氏酵母 酿酒酵母 |
经常与啤酒有害菌相伴 |
| 潜伏微生物 | 不能 | 不能 | 不能 | 能 | 芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌 肠杆菌 微球菌 |
能在啤酒中长时间潜伏存活 |
有害细菌
在整个酿造过程中，由于操作不慎或卫生条件不利，细菌污染随时都可发生。麦汁中虽然含有一定防腐能力的酒花树脂，对革兰阳性菌较敏感，但有些细菌对酒花树脂会出现习惯性耐受，因而仍不免有污染。发酵后期的啤酒，含有4%左右的酒精和较多的二氧化碳，并且处在厌氧状态（溶解氧＜0.03mg/L）以及低温、低PH值条件下，对细菌生长是不利的，但仍然难免有某些厌氧菌和微需氧菌污染。
啤酒厂中的啤酒有害菌主要有乳酸杆菌、四联球菌、果胶杆菌以及足球菌等，所占比例依次约为65%、28%、0.05%、0.02%，它们均能使酒体形成浑浊和沉淀，造成啤酒酸败，导致口味异常、口感变差。
革兰阳性菌
- 巴氏乳酸菌
- 这是啤酒中常见的一种杂菌，通常为长杆状（0.5~1.0）μm×（5~120）μm，形态多变，有时在麦汁中为短杆状，而在啤酒中为长杆状，细胞常连接成钝角形，不运动。该菌一般从大麦或麦芽中带入，如果啤酒受其侵害，即形成沉淀，摇动时便出现丝光样浑浊，并使啤酒产生酸味，这被认为是该菌的特征。在酵母琼脂培养基上，菌落边缘光滑，培养120~144h后即布满整个培养皿，在麦汁明胶上呈树枝状灰白色隆起，3%酒糟能促使发育，10%酒精即抑制其生长。营异型乳酸发酵，能发酵阿戊糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、棉籽糖、海藻糖和甘露糖，形成乳酸、乙酸以及二氧化碳，不还原硝酸盐。属于兼性厌氧菌，最适温度30℃，最适ph4~5，不抗热，0.15PU值左右可以致死。在淡色啤酒中，该菌生长较好；在黑色啤酒中，由于含有焦糖物质，其生长受到一定的限制。酒花树脂不能抑制其生长，但利用巴氏灭菌法能将其杀灭。在啤酒厂中，降低麦汁的ph值，同时使成品啤酒中残余的可发酵物质尽量减少至最低限度，并纯化酵母菌种，是防止该菌污染的较好措施。
- 四联球菌
- 球形很小，0.8~1.0μm直径，排列成对，也有单个的，在酸性培养基中趋向四联，在中性培养基中呈双球状，不运动。革兰阳性，荚膜染色可见到细胞周围有一层明显的圆形荚膜。买至培养基上菌落小，2~3mm，圆形凸起，光滑，边缘整齐。穿刺培养沿穿刺线生长，表面生长微弱，马铃薯上很少生长，在加油碳酸钙的麦汁培养基上，菌落周围形成透明圈，能使麦汁浑浊，产生沉淀，在肉汤琼脂上生长不良。能发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、阿戊糖，不发酵菊芋糖、糊精、淀粉，能产生双乙酰，不分解尿素。最适生长温度18~25℃，30℃以上不易生长，最适PH5.8，超过7.1不能生长，不抗热，2PU值可以致死。啤酒一经四联球菌污染，即表现发酸、变味、浑浊、甚至粘稠，使啤酒不能饮用。这是啤酒危害最大的一种病害微生物，多发生在下面发酵啤酒中（国内有家啤酒厂由于污染此菌，曾被迫停产3年）。四联球菌在微量二氧化碳存在下能很好地繁殖，如酒精含量1%~8%能刺激其生长，最适浓度为3%。在黑啤酒中比淡啤酒中生长迅速。如在PH5以下，由乙酰甲基甲醇产生双乙酰。
格兰阴性菌
- 变形黄杆菌
- 该菌是啤酒发酵时的好氧性污染菌，一般常在啤酒的发酵初期出现，形态多变，在麦芽中常常形成肥杆状。（0.8~1.2）μm~（1.5~4.0）μm，单个或成链状，不运动。在麦汁琼脂中形成一种黄色到橙黄色的色素，不产生孢子。能同化多种单糖和双糖，对加酒花或不加酒花的麦汁能产生少量挥发酸、不会发酸、双乙酰、痕迹酒精，并释放氢和二氧化碳。为兼性厌氧菌，在麦汁中生长最适温度为32℃，最适PH5.0，发酵初期生长很快，但在PH4.4以下，48h后便停止生长。很少有啤酒厂不污染此菌，酵母发酵不旺盛时，此菌发展较快，能使啤酒产生轻微的胡萝卜味。种酵母中常染此菌，浓度可达0.1%~10.0%。因为此菌在ph4.4以下即不能声张，故危害尚不严重，但发酵起发慢，能产明显的欧洲防风味道（胡萝卜味？反正是不好的气味），防止的办法就是让麦汁很快起发，发酵旺盛，PH值很快下降。该菌常常在上面发酵的酵母泥中找到。
- 大肠杆菌群
- 在较高的温度下能生长，世代时间极短，并能使麦汁产生芹菜味。在适宜的环境下，特别是在麦汁管路及冷却麦汁管路滞留区，或停工期间，这种细菌能很快地繁殖。生产时麦汁流经此处，便被感染至发酵罐中。即使该菌到达发酵罐后立即停止生长，其芹菜味也损害了啤酒的风味。所以，做好麦汁冷却段管路及设备清洁工作，是预防该菌污染啤酒的最好措施。
- 醋酸杆菌属
- 粗壮杆菌，（0.4~0.8）μm~（1.0~2.0）μm，细胞单独、成对或链状生长，有的菌株运动，运动性易变，运动菌株周生鞭毛。在啤酒中生长集中在液面，形成强的纤维菌膜，不生孢子，一般为短杆状，有的菌株在麦汁和啤酒中呈球状。好氧或微好氧性菌，适应广泛PH值，最适温度30℃，对酒花树脂不敏感，耐酸，能同化葡萄糖、乙醇、丙醇、乙二醇等产生乙酸，具有柠檬酸循环的酶，能进一步氧化乙酸为二氧化碳和水，酒精含量达8%~10%时受到抑制，能氧化乳酸钙为碳酸钙。能使啤酒浑浊、变味、发黏。
- 醋酸单胞菌属
- 粗壮杆菌，（0.4~0.9）μm×（1.0~2.0）μm，细胞单独、成对或链状生长，一般都运动，极生鞭毛。液体培养形成菌膜，不生孢子，一般为短杆状，有的菌株在麦汁和啤酒中呈球状。好氧或微好氧菌，有时菌株在绝氧条件下也能生长、最适生长温度为30℃，对酒花树脂不敏感，耐酸，能同化葡萄糖、乙醇、丙醇、乙二醇等产生乙酸，有限的氧化能力，只能氧化乙醇乙酸，具有柠檬酸循环的酶，不能氧化乳酸钙为碳酸钙，酒精含量6%以上时受到抑制。啤酒厂最危险的黏败酶，能使啤酒变浑浊、变味、发黏。
- 发酵单胞菌
- 原名嫌气五色杆菌，中等长度粗壮菌（1~1.5）μm×（2~3）μm，有时分散呈玫瑰花瓣状，幼细胞具有运动性，丛鞭毛，在啤酒中不运动。在麦汁中，即使酒花率高，PH4.0以下也能生长。无糖啤酒中不能生长，葡萄糖啤酒明胶培养基穿刺培养，沿穿刺线成浓密的念珠状，在培养基表面不生长，2%葡萄糖啤酒培养液中成浓密的浑浊物，最后形成大量沉淀，液清。不发酵糊精、麦芽糖、乳糖，但是能微弱发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，生成微量酒精和二氧化碳。生长ph为2.5~7.5，最适温度30℃，不还原硝酸盐，不形成乙酰甲基、甲醇及双乙酰，不液化明胶，不产生吲哚，不抗热，2.0PU值可以致死，耐酒精含量6%，8%的酒精含量可以完全抑制其生长。该菌为啤酒工业中非常危险的杂菌之一，啤酒感染后，兼有野生酵母及细菌感染最恶劣的缺点，但一般很少见。它有抵抗酒花的防腐能力，在酒花用量很高的啤酒中，甚至ph4.0以下，也能很快繁殖，能耐受高氢离子浓度，排除空气反而促使其发育。该菌还能使啤酒变成类似巴氏乳酸杆菌产生的浑浊物一样，形成浓密的丝状，但略少光泽，啤酒的香气被其破坏，气味极不好，兼有硫化氢臭气和苹果的香气，并有大量气体生成。它对葡萄糖的作用像酵母一样，能产生酒精和二氧化碳，在啤酒中常以星状的群体出现，不形成孢子。60℃5min即可被杀灭。
- 大肠菌群
- 主要包括：克氏杆菌属，埃希杆菌属。短杆菌（0.5~0.8）μm×（1~2）μm，不运动，不形成孢子。兼性厌氧菌，在猪胆盐存在时，培养在乳糖中，37℃、48h内产酸产气，最适合ph5.0~7.5，ph4.0以下既不生长，通过不同代谢途径，能分解葡萄糖，产生乳酸、乙酸、乙醇、二氧化碳和氢，在上述反应中，埃希杆菌生成等量的二氧化碳和氢，克氏杆菌则生成多量的二氧化碳、较少的乳酸和乙酸。此类菌的污染来源为土壤和水，在麦汁中生长很快，产生异味，危害甚大，在啤酒中因ph低，不易生长，麦汁冷却到1.7℃以下可以抑制其生长。防止的主要办法是麦汁及时接种酵母，不要延误时间。
主要的野生酵母
野生酵母是指不为啤酒正常生产所用，在啤酒酿造过程中，容易引起不正常发酵或者产生病害的异种酵母。有的野生酵母在啤酒生产中可引起严重污染，但不是所有的野生酵母都对啤酒有害。有的野生酵母对这一类啤酒可能是无害的，但是对另一类啤酒则可能是有害的，如酒香酵母属能赋予上面发酵蓝比克啤酒特殊风味，但对下面发酵啤酒来说，能引起异味，就是有害的了。
常见的野生酵母种类
酵母属中的非培养酵母。
其他酵母属如克氏酵母属、汉逊酵母属、假蝗酵母属、毕赤酵母属、圆酵母属、红酵母属、酒香酵母属等。
啤酒厂主要病害野生酵母菌的名称和特征
- 啤酒酵母浑浊变种
- 有假菌丝，卵形、椭圆形，有时腊肠形，大小为（2.5~8.0）μm×（5~12）μm；形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.5~5μm，25~30℃，40h内形成；在液体培养基中可形成菌膜，在13~15℃、8~10天形成，26~28℃、4~5天形成；在琼脂斜面培养，菌落呈淡黄色，软质，润湿，光滑，边缘为锯齿状，能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖1/3棉籽糖；上面发酵，不能同化硝酸盐，以乙醇为碳源，发育良好；能引起啤酒浑浊及刺鼻难闻的气味，在上面发酵啤酒中经常遇到。
- 巴氏酵母
- 有假菌丝，长卵圆形或腊肠形（2.5~4.0）μm×（7.0~26.0）微米。形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.4~5μm，25~30℃，40h内形成。琼脂斜面培养，菌落呈白色，润湿，光滑，边缘弯曲。在液体培养基中可形成薄的菌膜，在13~15℃、15~30天形成，26~28℃、7~10天形成。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、2/3棉籽糖；下面发酵，不能同化硝酸盐，能稍微同化乙醇。是下面发酵啤酒中危害较大的菌，引起浑浊，妨碍酒液澄清，产生令人厌恶的苦味及不愉快气味。
- 魏氏酵母
- 有假菌丝，长卵圆形，（4~8）μm×（9~18）μm，球形，滑面，形成孢子最适温度34℃，11h内形成。琼脂斜面培养，菌落软泥状，有光泽，稍皱，边缘弯曲。在液体培养基中可形成薄的菌膜。能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。
- 强壮酵母
- 有假菌丝，细胞伸长成腊肠形，（2~3）μm×（9~10）μm。形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.5~5μm，25~30℃，40h内形成。琼脂斜面培养，菌落呈淡黄色，软质，润湿，光滑，波纹状，边缘为锯齿状，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。在液体培养基中可形成菌膜，在13~15℃、10~15天形成；26~28℃、7~10天形成。下面发酵，以乙醇为碳源，发育良好。能使啤酒产生浑浊，危害较大。
- 糖化酵母
- 无假菌丝，圆形或椭圆形，（3~7）μm~（4~10）μm，能形成孢子，在液体培养基中不形成菌膜，能发酵糊精，使啤酒的发酵度异常高。使啤酒产生浑浊，酒味淡薄并形成异味。
- 柠檬形克氏酵母
- 无假菌丝，柠檬形的长椭圆或短椭圆形，（2~4.5）μm×（5~8）微米，不能形成孢子，在液体培养基中有时形成薄菌膜，能发酵葡萄糖，可使啤酒形成异味。
- 异常汉逊酵母
- 有假菌丝，圆形或椭圆形（2~5）μm×（4.5~10）微米。形成孢子，草帽状、角状，1~4个。琼脂斜面培养，菌落乳白色，无光泽，平摊，边缘丝状。在液体培养基中可形成菌膜，25℃、3天液面有白色菌膜。能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。能同化乙醇、硝酸盐，在空气存在下生长很快。
- 菌膜假丝酵母
- 有假菌丝，卵圆形或圆筒形，有时伸长，（3~4.5）μm×（4.5~10）μm，不形成孢子。菌落呈灰色，软质平滑，中央略高，边缘透明有细微皱纹。在液体培养基中可形成鲜黄色菌膜，初平滑，后变为褶皱。能发酵葡萄糖。在空气存在下，氧化乙醇，能同化葡萄糖、果糖、有机酸。使啤酒浑浊并产生不良气味。
- 膜醭毕赤酵母
- 有假菌丝，圆形、圆柱或椭圆形，（3~5）μm×（5~12）μm。形成孢子，球形、半圆形，1~4个。琼脂斜面培养，菌落乳白色或白色。在液体培养基中可形成白色干燥菌膜。能发酵葡萄糖。在空气存在下，能氧化乙醇，生长很快，使啤酒浑浊并产生异味。
- 球拟圆酵母
- 无假菌丝，圆形或椭圆形，（3.5~5.5）μm×（4~6.5）μm，不形成孢子。在液体培养基中不形成菌膜。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。属于耗氧酵母，若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。
- 平常球拟圆酵母
- 无假菌丝，卵圆形，（2~3.5）μm×（3~6）μm，不形成孢子。在液体培养基中偶尔形成薄菌膜。能发酵葡萄糖。若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。
- 胶红酵母
- 无假菌丝，卵圆形，（2.5~5）μm×（4~7）μm，不形成孢子。在液体培养基中不形成菌膜。若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。
- 布鲁塞尔酒香酵母
- 有假菌丝，卵圆形，（2.5~4）μm×（3~9）μm，不形成孢子。在液体培养基中形成薄菌膜，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖，能同化硝酸盐。对蓝比克上面啤酒是必需的。
生产阶段中的杂菌污染
糖化
适热乳酸菌：醪液保温50℃以下，容易感染适热乳酸菌，如载氏乳酸菌，产生乳酸菌，对降低醪液ph有利。50℃以上，此菌不易生长，因此不易染菌。
麦汁冷却至接种
- 大肠菌群
- 此类菌在40℃仍可生长，应该防止不洁的水混入麦汁中，此类菌繁殖极快，7h内可繁殖几百万倍，感染少量菌即铸成大害。并且不易消灭，连续发酵所使用的间歇麦汁更应注意避免污染此菌。
- 野生酵母
- 野生酵母常潜伏在管道的缝隙里、管子的接头螺纹上、入孔的垫料上等，当麦汁流经管道进入发酵罐中，着一些部位都是污染野生酵母的媒介。此外，也有由重复使用的种酵母中带入的可能。
- 醋酸菌、乳酸菌
- 此两种菌在麦汁中也能污染，但生长速度较慢。
发酵阶段
- 变性黄杆菌
- 此菌主要在酵母接种时污染，种酵母中一般均染有此菌，此菌能使酵母竞争繁殖，在发酵完毕前停止生长。
- 巴氏乳酸菌、醋酸菌
- 接种酵母中常有此菌，发酵时此两种菌可以生长，开口发酵有利于醋酸菌的生长，密闭发酵有利于乳酸菌的生长。
- 大肠菌群
- 种酵母中含有此菌。
- 野生酵母
- 野生酵母主要污染种酵母，尽管接种时污染率很低，但发酵完毕，回收的酵母中，野生酵母的污染率变大。
贮酒阶段
- 醋酸菌
- 好氧或微好氧醋酸菌在下酒或酒液上部存在空气时繁殖较快，半满的酒桶常会出现醋酸菌污染。
- 乳酸菌、嫌弃发酵单胞菌
- 此两种菌在厌氧条件下生长，乳酸菌虽然对酒花树脂敏感，但容易形成习惯性耐受。
啤酒生产中有害微生物的检查
病害细菌属的检查
细菌污染的检验方法
- 采用多种选择性培养基
- 利用同一选择性培养基
细菌检查的基本操作
- 取样的容器（如试管、三角瓶）
- 悬滴检查法
- 麦汁培养法
- 平面培养法
- 小滴培养法
- 厌氧菌的培养方法
各类污染细菌菌落的检出特征
- 乳酸杆菌属
- 四联球菌属
- 大肠菌群
- 多变黄杆菌
- 醋酸菌
- 发酵单胞菌
病害细菌属的鉴别
病害细菌属鉴别程序
啤酒有害菌的鉴别证明法
- 一般试验法
- 啤酒培养试验
主要有害细菌的简单鉴定方法
- 四联球菌检出证明法
- 乳酸菌的检测法
- 醋酸菌的检测法
- 酪酸菌的检测法