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=选择性培养基的应用=
培养基可以分为选择性培养基和非选择性培养基。选择性培养基只检测对产品有害的微生物，而非选择性培养基则可将所有存在的微生物都培养出来。
NBB是德国慕尼黑工业大学研制的一种啤酒有害菌专用培养基。该培养基由于加入了放线菌酮以及多种营养物质（如酵母浸膏、牛肉浸膏、葡萄糖、麦芽糖、L-苹果酸等），可以抑制酵母菌和啤酒无害菌的生长，为啤酒有害菌创造最适宜的生长条件。
另外，在NBB-A和NBB-B种，加入了酸碱试剂，以指示酸碱变化，遇酸变黄，遇碱变红。
培养基NBB几乎可以检测啤酒厂中的全部样品，如各类澄清样品、浑浊样品以及各种气体样品等，而且操作简单、鉴定迅速。当污染较严重时，样品只需培养1天即可；当仅有痕量污染时，微生物生长特别缓慢，培养时间也只需数天（在25~28℃条件下，NBB-A和NBB-B只需培养5天，而NBB-C只需要培养5~10天），与其他检测方法相比缩短了培养时间。另外，极其重要的一点是NBB培养基的检出选择性非常高，在所有的NBB产品中，只要保证严格的厌氧环境，则在其上生长的均为啤酒有害菌。此外，在好氧条件下，NBB的检测范围也较宽，即在所有的NBB产品中能够生长的都是啤酒有害菌和指示性微生物，尤其是NBB-B，检测指示性微生物的可靠性最高。
==固体培养基NBB-A==
NBB-A主要用于检测啤酒和酵母中存在的啤酒有害菌，它适用于培养已发现的所有啤酒有害菌，特别是乳酸杆菌、四联球菌以及果胶杆菌和巨型球菌等。常用的检测设备有：不锈钢漏斗式过滤器（有单联、三联和六联式三种规格）、喷灯（进行火焰灭菌）、低噪声真空泵、真空管、真空保护器、细菌计数器以及镊子等。
===使用方法===
使用时，先用沸水或高压蒸汽将瓶装NBB-A进行液化处理，在液化时避免长时间过度加热，然后将液化好的培养基约15ml立即倒入无菌平板中，置于冰箱中备用。但其贮存时间不应超过4天，否则培养基平板汇脱水干燥，而作为啤酒有害菌的乳酸杆菌对干燥非常敏感，在长时间贮存的NBB-A平板上不能生长。
===培养条件===
#培养温度
:一般控制在25~28℃培养，不能超过28℃。因为在较高温度下部分啤酒有害菌无法生长。
#培养环境
:由于所有的啤酒有害菌都是微需氧或严格厌氧的，所以，应在厌氧环境下进行培养。现在进行厌氧培养时，一般都采用厌氧培养罐。在米碧德厌氧罐里，通过化学反应，氧气被消耗掉，同时产生二氧化碳或氢气。当然也可以用CO<sub>2</sub>洗涤技术，先抽真空再充CO<sub>2</sub>，以达到厌氧环境。对常见的啤酒有害菌乳酸杆菌和四联球菌来说，这样的环境已经足够了，因为它们是微需氧菌，能够生活在二氧化碳与少量氧气的混合状态下。而对于较罕见的啤酒有害菌果胶杆菌和巨型球菌来说，由于它们是专性厌氧菌，只有在氧含量小于0.2mg/L时才能生长，因此，培养时，培养皿上最好有透气的凸点来完成内外的气体交换，以保证培养皿内有充足的二氧化碳。
#恒温培养时间
:一般为2~5天。培养时间取决于微生物的生长速率（取决于种、属）、菌龄、生理条件、培养的环境以及微生物的起始细胞数等。如果样品中有大量的啤酒有害菌，那么在2~5天内培养基中的酸碱指示剂将因有害菌产酸而变黄；如果样品中只有很少的啤酒有害菌存在，那么培养基只有菌落的边缘区域会变黄，而且颜色的改变通常需要4~6天。
===应用范围===
*检测酵母
:取0.1~1.0ml酵母涂布，接种在NBB-A平板上，要求图层薄而均匀。被涂上的酵母在NBB-A上几乎不生长，而酵母中的啤酒有害菌却能良好生长，因此，在显微镜下很容易检查出来。在大多数情况下，特别是在较严重污染啤酒有害菌的情况下，NBB-A将会变黄。
*检测啤酒、水等澄清透明的液体
:将被检测样品进行膜过滤，过滤量为50~100ml。最好使用普通孔径0.45μm的白色过滤膜，做完膜过滤后，将过滤膜置于NBB-A上。具体步骤如下：
::#启封成品培养皿包装，编号。
::#用定量注射器将3.5ml无菌水均匀湿润培养基，无菌操作。
::#打开真空阀，用喷灯对过滤器仔细灭菌10s。
::#用喷灯对过滤漏斗内部彻底灭菌。
::#将过滤膜片小心取出放到过滤器上部。
::#将漏斗与过滤器连接好后再灭菌处理。
::#将待过滤样品倾入漏斗中，压好上顶盖。
::#启动真空泵抽滤，结束后取下过滤膜片。
::#将富集被截留物质的膜片放入培养基中。
::#放入培养箱（厌氧）中进行恒温培养。
:需要注意的是，有些菌种如林德氏乳酸杆菌在NBB-A上培养时，特别是在放置时间较长的NBB-A上，由于缺乏水分以及营养物质不能流动而造成多肽类营养物质（如P-因子）匮乏，使得这些菌种在过滤膜上不能生长或生长缓慢。因此，检测重要样品时，在将过滤膜置于NBB-A上的同时，也应将此同一样品的过滤膜置于NBB-B中培养。
*检测需要划线培养的样品
:需要划线的样品通常是经过NBB-B和NBB-C处理过的样品。因为NBB-B和NBB-C都是液体培养基，所以不能做菌种特性鉴定。在不清楚NBB-B和NBB-C种生长的啤酒有害菌属于哪一类型的情况下，可以用接种环从富集培养的样品中取1~3环，在NBB-A上做平板划线分离或平板划线增殖，待长出菌落后，即可进行鉴定。
===检测结果鉴定===
*酵母
:由于NBB-A中有放线菌酮，因此，培养酵母不能生长，而野生酵母却能生长，但颜色不会变化。
*非啤酒有害菌
:非啤酒有害菌包括小球菌、醋酸菌等，它们是典型的需氧菌，在NBB-A上一般不能生长。当膜过滤器中、膜片下残留有氧，或厌氧环境失败而达不到厌氧条件时，这些非啤酒有害菌可能会生长。但是这些非啤酒有害菌的生长是非常微弱且缓慢的，通常NBB-A不会变黄（醋酸菌可引起菌落周边区域变黄）。另外，非啤酒有害菌的乳酸菌，大部分在NBB-A上生长非常微弱、缓慢，而且在啤酒和酿造酵母中出现的概率非常小。
:经膜过滤后，大量样品的死细胞和非啤酒有害菌会再次滞留在滤膜上。因此，不能以直接镜检膜片的结果作为判断依据。在NBB-A上判断有微生物生长的依据是有菌落形成，并且通常伴随有NBB-A颜色的改变。
*啤酒有害菌
:如果有啤酒有害菌，则NBB-A会显著变黄，并在NBB-A上生长出无色、白色至黄色的直径为0.5~3.0mm的菌落。反之，通过NBB-A变黄，可以判断所检验样品中可能存在啤酒有害菌。在不能确定是否有啤酒有害菌的前提下，特别是在NBB-A上仅有零星的、不规则斑点的菌落生长时，可将此村中菌落接种到低酒花啤酒中，来确定它们是否会对啤酒产生危害。若此菌落在低酒花啤酒中能生长，则是潜在啤酒有害菌；若此菌落在低酒花啤酒中不能生长，则为啤酒无害菌。
:当然，啤酒厂的最佳状况是NBB-A上的样品结果为阴性，即在NBB-A上无菌落生长出来。
==液体培养基NBB-B==
NBB-B液体培养基检测范围较广，能检测酵母、麦汁、浑浊啤酒、二氧化碳气体、压缩空气、成品啤酒以及啤酒生产过程中的二次污染等。其使用方法是，在无菌状态下将瓶装NBB-B分装到无菌试管中（每支试管10~20ml），或再次短时灭菌。短时灭菌应该避免过热，否则容易使已经形成的轻微蛋白质沉淀加强，指示剂颜色加深，同时其它营养物质和酒花苦味物质也会受到不良的影响。同NBB-A一样，NBB-B也是在25~28℃恒温厌氧培养，试管口要用一个透气的塞子（如棉塞）来保证气体的交换。培养时间为2~5天。
===检测酵母===
酵母样品的检测应该最严格，所以不仅要检出专性啤酒有害菌，而且应该检出所有的潜在啤酒有害菌及间接啤酒有害菌，在有氧条件下还需检出可能存在的指示性微生物，如醋酸菌、肠杆菌、多变黄杆菌等。NBB-B检测指示性微生物的可靠性最高。
*检测方法
:用NBB-B检测酵母的方法主要有两种：
:#用无菌吸管取0.5~1ml酵母置于10~20ml NBB-B中，按此比例可检测更多的酵母。或在酵母容器不同的位置，直接采用无菌棉签取酵母或沉积物样约0.5ml于无菌试管内，然后注入约70%的NBB-B培养基（约15ml）。由于酵母的加入，一开始会有发酵现象，产生二氧化碳，因此，培养时是自然的厌氧（二氧化碳）环境，无需再做厌氧处理。然后，在NBB-B中抑制剂（如放线菌酮）的作用下，纯种酵母很快停止生长，可能存在的啤酒有害菌会充分地利用剩余的营养及生长物质。当然，对于NBB-B样品也可进一步做厌氧处理，以更好地检出乳酸杆菌、四联球菌等啤酒有害菌。
:#对于较大量的酵母1~4ml，可采用50ml卡箍式取样瓶，其中装入20~30ml NBB-B。当酵母量再增大时（10ml），则可以采用NBB-C来检测。
::对于上述两种方法，如果酵母量大或酵母沉淀结实，就有可能出现其中的单个微生物接触不到NBB-B培养基的情况，此时必须借助摇床等方式，使培养液能够缓慢摇荡，摇床转速一般为125r/min。由于震荡作用，酵母不能沉降，可能存在痕量污染的啤酒有害菌就能够得到较好的营养，因而检出灵敏度将提高。
*检测结果鉴定
:在达到一定污染程度或有典型啤酒有害细菌存在时，NBB-B中的酸碱指示剂会由红变黄。但是，在痕量污染（极轻微的污染）时，NBB-B将不变黄；巨型球菌、潜在啤酒有害菌多变黄杆菌以及发酵单胞菌不能使pH值降到5.0以下，因而不会让NBB-B变色；若酵母自溶产碱，会使pH值上升，也导致NBB-B不变黄等，因此，对于用NBB-B培养后的酵母，一定要做直接镜检。
:在NBB-B中，啤酒有害细菌会迅速、大量生长，因而在显微镜下很容易识别出来，一般在一个视野中会出现多个可疑细胞。如果细胞为单个形式，当放大倍数为600倍时，10个视野中只存在1~3个细胞，则表明此微生物为死细胞或无害微生物，在用NBB-B培养之前它们已经存在于样品中了。如果无法确定这个NBB-B培养后的结果，可以将这个经NBB-B培养后的样品再次接入NBB-B中，经过这样的二级培养后，如果样品中存在啤酒有害菌，那么在两天内就会迅速生长出来，导致NBB-B变色。
===检测麦汁===
用NBB-B检测麦汁常有两种方法。
*180ml卡箍式取样瓶中加入40ml麦汁，再加巴氏灭菌后啤酒100ml，再加入NBB-B 10ml，在25~28℃条件下，恒温培养5天。如果存在啤酒有害菌，则液体变浑浊。这里不是看颜色变化，而是看是否产生浑浊。若麦汁直接进行保存培养，是不会生长啤酒有害菌的，所以，需要加啤酒来创造选择性的培养环境，以检出啤酒有害菌。
*膜过滤40~50ml麦汁，过滤膜置于NBB-B中，在25~28℃条件下，恒温培养5天，观察颜色变化。如果存在啤酒有害菌，则NBB-B将变黄。
===检测浑浊啤酒===
浑浊啤酒主要指前酵液、后酵液等含有酵母的酒液，可用一个较大的瓶子（如500ml卡箍式取样瓶）取样后置于冰箱中，使酵母沉淀。若有啤酒有害细菌存在，则会随浑浊物一起沉降至底部，上清液可以倾倒掉，用无菌吸管或无菌棉签取底部沉淀大约0.5ml，然后用与上述“检测酵母”相同的方法处理样品。这样检测未过滤的浑浊啤酒，所检出微生物会受到一定的限制，但样品培养时间较短。实际上，最好用NBB-C来检测浑浊啤酒。
===检测压缩气体、二氧化碳===
取20~30ml NBB-B于50ml卡箍式取样瓶中，让气流低速充入其中，约1min。注意气体流速不能太大，一面将压缩气体或二氧化碳中的啤酒有害菌直接带出取样瓶，而不被检测到。
===检测清酒、成品啤酒===
主要有以下三种检测方法：
*膜过滤法
:过滤100ml啤酒，然后将过滤膜卷起置于NBB-B中，在25~28℃条件下，恒温厌氧培养5天。如果存在啤酒有害菌，则NBB-B将变黄。
*直接加入法
:将成品罐装啤酒开盖，加入10~15ml NBB-B（只需将瓶颈灌满即可），然后封上瓶盖，在样品保存培养箱中培养。由于NBB-B可提供营养，能促进啤酒有害菌生长，所以培养时间只需10天，而不是6周。如果样品中存在啤酒有害菌，培养时会形成浑浊、沉淀，但是没有颜色变化。这里也是看浑浊、沉淀，而不是看颜色变化。
*过滤膜和啤酒混合法
:这是检测专性啤酒有害菌的最佳方法。具体方法是，未超过保质期的清亮无菌啤酒倒入50ml无菌卡箍式取样瓶中，装至瓶颈出，然后放入过滤100ml啤酒之后的过滤膜，并用NBB-B注满取样瓶。若样品量较大，可取40ml样品放入50ml卡箍式取样瓶中，剩余样品全部做膜过滤，然后将过滤膜放入取样瓶中，用NBB-B灌满取样瓶。如果样品中存在专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌，那么，在25~28℃条件下，恒温培养5天的过程中，将会出现浑浊、沉淀，但是没有颜色变化（因为已高度稀释）。
:需要注意的是，在培养初期，卡箍式取样瓶的瓶盖不能盖紧，以免产生过高压力，抑制可能存在的微生物的生长，甚至炸裂取样瓶。即使不炸裂，在打开取样瓶时也会引起样品四处飞溅，影响实验结果和操作过程。
===检测啤酒生产过程中的二次污染===
用NBB-B和无菌棉签配合，可检测啤酒生产过程中造成的二次污染。用无菌棉签擦拭样品，在25~28℃条件下培养3天，是否做厌氧处理均可，因为试管中的NBB-B有一定高度，能深层培养。若第一天NBB-B变黄，表明样品污染严重，啤酒有害菌已经适应了啤酒的环境，随时可能迅速蔓延；若第二天变黄，表明有危险的菌类在醋酸菌的菌囊中繁殖，菌囊形成了啤酒有害菌生长的理想环境；若第三天变黄，表明醋酸菌的黏稠液结块，清洗不够，仅为痕量污染。总之，若3天内变黄表明样品有问题，若3天后变黄则表明样品没有问题。这里只看颜色变化，没有必要做进一步镜检。
除此之外，鉴定擦拭样品的另一个重要依据是：观察是否形成浑浊，而鉴别四联球菌则必须制片镜检。
==浓缩型液体培养基NBB-C==
顾名思义，浓缩型NBB-C中含有更多两的放线菌酮，可以更好地抑制酵母生长。所以，'''NBB-C特别是用于未过滤浑浊啤酒的检测'''，也可用于较大量酵母样品的检测。当检测酵母样品时，在培养初期酵母仍能短期发酵，产生二氧化碳，形成厌氧环境，因此，可不必做厌氧培养，这一点同NBB-B检测酵母样品一样。
在NBB-C中，没有酸碱指示剂，不能指示颜色变化。而且，NBB-C只能在有啤酒成分的条件下使用，即只能和啤酒结合使用，否则，啤酒的选择性会丧失。
===检测范围===
NBB-C培养基检测范围也较广，能检测水、麦汁、酵母、浑浊啤酒、过滤后清酒以及成品啤酒等。下面分别加以叙述：
*检测水和麦汁
:将50ml样品（例如接种麦汁或最后冲洗水）放入180ml卡箍式取样瓶中，并加入约8ml NBB-C，然后用巴氏灭菌后啤酒灌满取样瓶，以增强选择性。在25~28℃条件下，恒温培养5天，不需要做厌氧培养。
*检测较大量酵母
:在180ml卡箍式取样瓶中或250ml三角瓶中，加入10ml酵母、4~8ml NBB-C、10~40ml无菌水和约60ml巴氏灭菌啤酒，在25~28℃条件下，恒温培养7天。由于此处酵母量较大，容易出现酵母样品中的某个微生物细胞不能接触到NBB-C和啤酒的情况，因此，最好采用摇床培养。摇床的转速一般为125r/min，由于震荡作用，酵母不能沉降，进而能与NBB-C、啤酒充分接触，这样，可使酵母中可能存在的痕量啤酒有害菌得到较好的营养，提高检出痕量污染的灵敏性，缩短检出污染的时间。同样，由于酵母的短期发酵，取样瓶中的样品可以不做厌氧处理。但是，在培养初期，取样瓶盖只能盖上而不能扣死。
*检测浑浊啤酒
:最常用的处理方法是取120~150ml浑浊啤酒，加入到180ml卡箍式取样瓶中，再加入3%~5%的NBB-C，最后用无菌水充满取样瓶。若浑浊啤酒量特别大（如1~2L），可以将上清液进行膜过滤，而将下面的酵母悬浊液和过滤膜一起放入卡箍式取样瓶中，再加入5%NBB-C，最后用无菌水充满取样瓶。
:使用无菌水，不仅可以毫不费力地将取样瓶灌满，而且可以降低啤酒中酒花苦味物质对微生物的抑制作用，使潜在啤酒有害菌也能够生长出来。最重要的是，在相同的培养条件下（25~28℃、7天），不同的加水量对培养结果将有明显的影响。
:#啤酒样品（约150ml），再添加3%~5%NBB-C，再用啤酒样品充满取样瓶，不添加水，可以检出专性啤酒有害菌。
:#啤酒样品（约150ml），再添加3%~5%NBB-C，再用啤酒样品充满取样瓶，再添加10%无菌水，可以检出专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌。
:#啤酒样品（约100ml）+3%~5%NBB-C，再添加20%无菌水，再用无菌水充满取样瓶，可以检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌以及间接啤酒有害菌。
:#啤酒样品（约100ml）+3%~5%NBB-C，再添加20%无菌水，不充满取样瓶，可以检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌以及指示性微生物。
:需要注意的是，用NBB-C检测含有酵母的样品时，在取样后应立即进行，否则，取样时摄入的氧气会使酵母立即生长（在瓶内产生压力），而且也会影响可能存在痕量污染检测结果。
:由此可见，通过选择加水量，NBB-C不仅可检测出专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌，还可检测出间接啤酒有害菌和指示性微生物。
:在上述方案中，使用NBB-B培养基也能达到相类似的结果，即在过滤后的啤酒中加入10%NBB-B，在厌氧培养时，可检测出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌及间接啤酒有害菌；而在有氧培养时，可检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌和指示性微生物。
*检测过滤后清酒、成品啤酒
:在过滤后清酒、成品啤酒中，直接加入50%的NBB-C，然后按下述方法处理：
:*采用无菌水注满取样瓶，可以赶走瓶口的空气，使瓶内液体有一定深度，这样，瓶底部氧气含量将非常低，酒中又有一定量的二氧化碳，会自然构成厌氧环境。
:*直接做厌氧处理。在25~28℃条件下，恒温培养7天。
:需要注意的是，虽然NBB-B和NBB-C都可用取样瓶培养，但是通常情况下，一般用NBB-B检测清酒、成品啤酒等不含有酵母的样品，而用NBB-C检测浑浊啤酒等含有酵母的样品。而且，二者的添加比例也不一样。例如，检测清酒、成品啤酒时需用5%~20%的NBB-B，以检测所有的啤酒有害菌、野生酵母和培养酵母；而检测浑浊啤酒等含有酵母的样品时，需添加大约5%的NBB-C，以抑制培养酵母的生长。
===检测结果鉴定===
由于NBB-C中不含酸碱指示剂，培养后不会有颜色变化，因而，也就不能依靠颜色是否改变来判断是否有啤酒有害菌。但是在NBB-C中啤酒有害菌生长十分迅速，很容易在显微镜下识别出来。
*检测较大量的酵母、浑浊啤酒等浑浊样品
:对于这类浑浊样品，其结果一般用下列两种办法进行鉴定：
:#通过形成新的浑浊和沉淀鉴定
::尽管这类样品是浑浊样品，但由于微生物生长时会形成新的浑浊和沉淀，所以浑浊和沉淀的数量必然会增加。正因如此，我们可以通过形成新的浑浊和沉淀来判断是否有啤酒有害菌存在，根据形成新的浑浊和沉淀的时间长短来判断污染的程度。若3天后形成新的浑浊和沉淀则表明是严重污染，6天后形成新的浑浊和沉淀则表明是痕量污染。
:#通过镜检鉴定
::虽然如上所述，可以通过形成新的浑浊和沉淀的时间来鉴定，但大多数情况下，仅通过浑浊、沉淀仍无法判断是否有微生物生长，必须取其浑浊、沉淀物进行涂片、镜检。
::在酵母沉淀中，由于酵母自溶产物会引起pH值上升，这样就给啤酒有害菌提供了较好的营养物质和适宜的pH值，因此，啤酒有害菌很容易生长，特别是四联球菌，如果进行镜检，将很容易观察出来。
::在600倍显微镜下，若每个视野中超过50个细菌，则被鉴定为有污染；若每个视野中只有1~5个细菌，则被鉴定为非啤酒有害菌。如果想进一步进行鉴定，可将沉淀培养于NBB-A上，同时，取一滴培养与NBB-B中。若在NBB-A上形成菌落，在NBB-B中形成浑浊，则该菌为潜在有害菌；若在NBB-A上形成菌落，在NBB-B中不形成浑浊，则该菌为啤酒无害菌或死亡细菌。
::对于四联球菌来说，若每个视野超过100个细菌，则为严重污染；若每个视野小于20个，则为痕量污染。
*检测水、麦汁、过滤后清酒以及成品啤酒等澄清液体
:由于这类样品是清亮样品，所以可通过浑浊、沉淀来判断。当样品内有污染存在时，必然能观察到严重的浑浊或沉淀。若样品无浑浊或沉淀，可不必进行镜检，鉴定结果为无污染；若样品有浑浊和沉淀，则同上述“加大量酵母、浑浊啤酒等浑浊样品”一样进行鉴定。