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===细菌污染的检验方法===
*采用多种选择性培养基
**麦汁：主要污染菌有醋酸菌、大肠菌群、多变黄杆菌
**#采用Mac Conkey琼脂培养基。大肠菌群可以在1天内检出，多变黄杆菌在3~4天内检出。
**#采用葡萄糖-酵母浸膏琼脂，内含10mg/L放线菌酮为基础培养基。在绝氧情况下培养，醋酸菌不生长；培养基中添加10mg/L多黏菌素（Polymyxin），可全部抑制多变黄杆菌的生长；若将基础培养基的ph值调节到4.0，大肠杆菌和多变黄杆菌不能声张。在供氧情况下，醋酸菌以黄色菌落出现。
**种酵母：主要污染菌有多变黄杆菌、乳酸菌、醋酸菌
**#醋酸菌的检查。啤酒琼脂加酵母浸膏，调节ph值到4.0，添加10mg/L放线菌酮，在倒入培养皿前，添加4%酒精，30℃好氧条件下培养。
**#乳酸菌的检查。不加酒花的啤酒琼脂培养基，添加酵母浸膏、麦芽糖、酪蛋白水解物和肝浸膏，调节pH值到6.5，添加10mg/L多黏菌素和10mg/L放线菌酮，以抑制多变黄杆菌和酵母的生长，在25℃，二氧化碳绝氧条件下培养，以抑制醋酸菌。
**#多变黄杆菌的检查。深层肝琼脂（deep-liver agar）培养基添加10mg/L放线菌酮，在30℃下供氧培养，多变黄杆菌生长极快，乳酸菌和醋酸菌生长较慢，容易区别。
**上述方法培养几天才能得到菌落，乳酸菌则需要7天以上，时间太长。作为常规检查可采用如下快速方法：利用Fuchs-Rosenthal载片（室容量3.2mm<sup>3</sup>）用作加酒花的啤酒明胶培养基，调节pH值到4.0，添加10mg/L放线菌酮，在30℃下培养24~36h，多变黄杆菌因pH值低受到抑制，不易形成菌落，乳酸菌和醋酸菌形成的小菌落可以镜检，也可从菌落形状加以区别，醋酸菌为球形，乳酸菌为分枝状。
**啤酒：主要污染菌有嫌气发酵单胞菌、乳酸菌、四联球菌
**#啤酒培养基+葡萄糖（2%）+酵母浸膏（0.05%）+放线菌酮（10mg/L），在绝对厌氧条件下可以检出嫌气发酵单胞菌。
**#葡萄糖+酵母浸膏琼脂培养基+10mg/L放线菌酮+0.3%（体积分数）苯乙基醇，在嫌气条件下可以检出乳酸和四联片球菌。
**洗涤水：主要污染菌有上述各种菌，分别采用上述选择性培养基进行检验。
*利用同一选择性培养基
:利用李氏多级选择性培养基（Lee's differential agar），简称LMDA。
:培养基成分：番茄汁固形物2%（Difco 6035或同类产品），胨化牛奶2%，酵母浸膏1%（Difco 0127或同类产品），葡萄糖1%，泛酸钙0.2%，柠檬酸0.11%，碳酸钙0.5%，磷酸氢二钾0.05%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.001%，硫酸铁0.001%，氧化钠0.001%，吐温80（Tween80）0.05%，溴甲酚红绿0.0022%，放线菌酮0.0007%，琼脂1.5%。121℃蒸汽灭菌10min，温度不宜过高。
:可以鉴别出多种污染细菌，培养基中加放线菌酮是为了抑制酵母生长；加碳酸钙是为了鉴别产酸菌；加溴甲酚红绿是为了鉴别着色物质。每个培养基可装15ml培养基，凝固后，于30℃避光保存，避免干燥。培养基应及时使用，或放在5℃下保存。此培养基除对醋酸菌进行有氧培养外，均采用厌氧培养；如果加入苯乙醇0.3%，只能用于分离格兰阳性菌。
:培养时，最初两天出现大肠杆菌和多变黄杆菌，4天后，大多数醋酸菌被检出，四联片球菌的检出则需要较长时间。
===细菌检查的基本操作===
*取样的容器（如试管、三角瓶）
:首先应用棉花塞紧，放在120~150℃干燥箱（或高压蒸汽箱）内，灭菌1h，冷却备用。在使用时，先将瓶外部用75%消毒酒精涂擦杀菌，然后将堵塞瓶口的棉花用火焰杀菌，再用手将棉花塞取下，将欲取的样品放入。此时应尽量保持无菌状态（包括被取样部位的灭菌操作）。
:取样后立即塞紧棉塞，随即用防水纸封住瓶口棉塞，用绳子扎紧，以便进行细菌检查。若长时间放置，则样品中的微生物即各自适应其生活环境而进行发育繁殖，以至于与最初状态显著不同，使实验结果发生错误。
*悬滴检查法
:此法虽然不太准确，但可以迅速确定麦汁和啤酒内所含细菌的大致情况。检查方法：用接种针（外径2mm）取样品做点滴镜片，详细计算点滴中的细菌数，并分别以杆菌、球菌、酵母等记录，即可判定欲试溶液中细菌的存在情况。但同样试验应做两次以上。
*麦汁培养法
:此法虽不易正确判定，但最为简单。将试样以无菌操作接入麦汁内，搅动均匀后，放入25~30℃恒温培养箱，每日观察培养基的变化，即检查浑浊、变色、沉淀、生成膜和发酵等情况。至第4天停止培养，并检查其气味等。按下述大致标准判定其微生物。
:#轻度的浑浊是由乳酸菌或小球菌（Pediococcus）等引起的；红褐色的浑浊是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）的特征；赤色浑浊是由赤色细菌或酵母所引起的。
:#最初容器底生成浮游物，溶液透明，然后全麦汁铺满菌丝，而溶液仍透明，这是霉菌类孢子发育的现象。
:#开始生成浑浊，逐渐生成沉淀，第4天则浑浊与沉淀都有，此是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和野生酵母的特征。
:#最开始生成浑浊并伴有发酵现象，第4天生成沉淀而溶液透明，是培养酵母；发酵后仍浑浊的是野生酵母。
:#出现浑浊及膜，不生成沉淀，主要是醋酸菌或产膜酵母；出现浑浊皮膜及沉淀的，是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和两三种野生酵母。
:#实验中的第3天，沉淀与浑浊皆轻微时，是发育不良或繁殖力极弱的特征，例如乳酸菌等。生成大量的沉淀与浑浊的，则是繁殖力强或适合于此麦汁的表现，如Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和很多种的酵母等。
:#生成浓厚而坚固的沉淀，是培养酵母；生成泥装沉淀是其他种酵母；飘动的沉淀是细菌。
:#黄白色的沉淀都是酵母或细菌；暗灰色或灰黄色的沉淀是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属），赤色浑浊及沉淀主要是赤色酵母；沉淀很少是赤色细菌。
:#试验第1天培养基不伴有其他变化，首先形成皮膜的是需氧型细菌，特别是醋酸菌、枯草杆菌和产膜酵母。
:#页面成白色随即生成厚的干燥皮膜，然后呈灰白色，有皱纹，并在培养器的边缘上高出且向上的是产膜酵母；柔滑而薄并稍有皱纹，然后干燥成灰色的是醋酸菌；呈有黏着力皮膜的是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）。
:#酯香的生成是由产膜酵母等引起；酸味的生成是由产酸菌引起；其他微生物亦可生成特有的气味。
*平面培养法
:主要目的是判定试样中的微生物数目。由于目的不同，培养基分别使用麦汁、中性麦汁、酵母水和肉汁等固体培养基。欲试样品常用液体，如欲试试样为固体时，可将一定量的该试样放入10ml无菌水中充分震荡混合，制成生物分散液。培养时先将试管培养基在水域中溶解，冷却到40~50℃，在无菌箱（或无菌室）中用杀菌锅的吸管吸取样品1ml，注入试管和培养基混合均匀后倒入双重皿中。立刻加盖转动使培养基均匀分布在双重皿内，凝固后倒置在25℃恒温箱内培养2~4天，数其发育的菌落数。以1ml样品中的微生物总数表示其结果，或分别记录其霉菌、酵母、细菌数。
:试验空气的平面培养法，将带有固体培养基的双重皿暴露于空气中5min，用于吸收空气中的试验样品，亦按同样方法保温培养，数其菌落数。
*小滴培养法
:这个方法在判定样品中微生物种类（大致区分为霉菌、酵母、细菌三类）相互间量的关系时使用。此法与酵母纯粹培养方法相同。取消毒锅的镊子、接种针、凡士林油、酒精灯、钢笔尖等器械放入无菌箱内；取一片凹穴载玻片，用火焰消毒后，再用钢笔尖沿其凹形上周涂抹凡士林，倒立于无菌箱内壁；再取盖玻片以镊子夹住通过火焰杀菌。用以火焰杀菌过的钢笔尖蘸取样品，点于盖片上，点成3×3或4×4，共9或16个小滴，迅速将盖片上的小滴按入凡士林油的载片的凹形圆环中，两片之间凡士林油不得有空隙。用显微镜检查，记录其中酵母或细菌情况；然后放入恒温箱中，25℃培养3天再检查其中繁殖情况，并分别计算霉菌、酵母和细菌百分率，此试验最少要检查20滴以上。
*厌氧菌的培养方法
:啤酒的污染多为细菌污染，主要是由乳酸杆菌和啤酒片球菌所引起。这些菌均属于兼性厌氧菌，一般要在厌氧条件下才能检出。
:利用物理和化学方法，对培养环境进行除氧，创造有利于厌氧微生物生长的条件用以培养检测厌氧菌。
:#厌氧罐：厌氧罐（gas pak）是一种操作安全、高强度塑料制作的厌氧培养罐，罐体透明，罐内设置有低温催化剂、气体发生袋和快速无氧指示剂。
:#机械方法除氧：对于专性厌氧微生物的培养，则需要严格的厌氧条件，可采用机械方法除氧，以达到无氧或微氧的培养条件。首先将罐内抽真空，然后使用CO<sub>2</sub>或者N<sub>2</sub>、H<sub>2</sub>与CO<sub>2</sub>的混合气体填充罐。
===各类污染细菌菌落的检出特征===
*乳酸杆菌属
:菌落周围有明显的晕区，晕区大小因菌种而异，培养基颜色由绿变棕黄，菌落圆形，中心深绿色，表面由光滑到粗糙，因品种而异。
*四联球菌属
:菌落教乳酸菌属小，呈黄绿色，极易和乳酸菌属区分，菌落周围亦有清晰晕区，晕区只限于菌落周边，延长培养时间，晕区增大，菌落颜色无改变，菌落为圆形，表面光滑。
*大肠菌群
:埃希菌属菌落圆形，透明，表面极光滑，无晕区；大肠杆菌属的菌落较啤酒其他细菌多得多，光滑，明亮，延伸在培养基表面类似煎蛋状，蓝绿色到黄绿色，因品种而异，无晕区。
*多变黄杆菌
:菌落呈蓝绿色，圆形，边缘及表面粗糙，无晕区，中心颜色略深。
*醋酸菌
:在好氧条件下生长、产酸，菌落周围有晕区，菌落光滑到粗糙，因品种而异，菌落底部呈蓝绿色而乳酸菌菌落底部呈黄色，容易区别（再延长培养时间时，乳酸菌也能在好氧条件下生长）。进一步还可以利用过氧化氢（双氧水H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>）反应区分，醋酸菌对过氧化氢酶呈阳性，而乳酸菌为阴性。
*发酵单胞菌
:菌落圆形，光亮、蓝绿色，较大肠菌群菌落小，不延伸，无晕区，延长培养时间色泽无变化。
==病害细菌属的鉴别==
===病害细菌属鉴别程序===
[[文件:病害细菌属鉴别程序示意图.jpg]]
通过上述程序，病害细菌的属明确后，再进一步利用形态和生理特点鉴别菌株。需氧菌和兼性厌氧菌含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢，在活性检查时呈阳性反应。微需氧菌和厌氧菌不含过氧化氢酶，不能分解过氧化氢，在活性检查时，呈阴性反应。
===啤酒有害菌的鉴别证明法===
啤酒有害菌按其性质大致可分为两种：
::*不论其开始存在的数目有多少，均影响啤酒的质量，例如醋酸菌、乳酸菌、小球菌（Pediococus）和集中野生酵母等。
::*本来没有有害性质，但由于其能繁殖，而对酵母的发育和发酵起到有害作用，例如Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）、酪酸菌、野生酵母等。
*一般试验法
:发酵实验有开放发酵试验和密闭发酵实验两种，除特殊要检查厌氧菌外，一般仅用开放发酵实验。
:#开放发酵实验
::已添加酵母的发酵液可直接注入已杀菌的三角瓶中。弱势未加酵母的样品，可取一个已杀菌的小三角瓶于无菌箱中，加入杀菌麦汁，再加入样品，放入25℃恒温箱中培养发酵。同时，另取一个已杀菌的三角瓶加入杀菌麦汁及纯粹培养酵母进行对照试验。观察其3天间的发酵状态，大约3天即可发酵结束。属于上述两种情况中的第一种有害菌，一般是在发酵终了后开始发育并显示其有害作用。因此，需要再于恒温箱内放置3~4天，然后与对照试验相比较。由沉淀、浑浊、皮膜的有无以及臭味等来判定所给予的影响。
:#密闭发酵实验
::最初阶段和开放发酵试验方法相同，即取2只100ml已杀菌的三角瓶，各放入60~70ml已杀菌的麦汁，用已在酒精中浸泡过的胶塞塞紧（注意不得存留空气）。然后用钢丝拴牢，以防试样发酵将瓶塞冲脱。以后的检查方法和开放实验相同。此外，也可以将样品与无菌啤酒一通注满三角瓶加胶塞，直接进行密闭试验。但此法不如前法全面，需氧菌过多时可采用。
*啤酒培养试验
:在杀菌啤酒（或无菌啤酒）中加入样品与发酵实验一样放入25℃恒温箱中，3~4天后进行检查。使用杀菌啤酒与杀菌时所损失的酒精量，应在操作时在无菌箱中事先以酒精补充。所谓无菌啤酒，是杀菌麦汁加纯粹培养酵母，经发酵后制得；这种啤酒除实验室培养的酵母以外，不存在任何菌类。用此方法可以试验已选定的菌对啤酒的影响，如醋酸菌、产膜酵母等。
===主要有害细菌的简单鉴定方法===
*四联球菌检出证明法
:四联球菌（Pediococcus）在酿造用语上亦称之为伤心菌（Sorcina）或啤酒伤心菌，是啤酒有害菌中最为严重的一种。鉴定方法如下：
::取已杀菌的100ml三角瓶，加入样品5ml、酒精2ml和10%碳酸钠3ml，然后加酵母水40ml（酵母水的制备：取压榨酵母100g，放在大烧杯中，注水1L，煮沸30min过滤，过滤后，用1mol/L氢氧化钠中和，如有沉淀或不清，再过滤。放入试管或富氏瓶和平底烧瓶中，以棉花塞紧，用蒸汽杀菌，每日每次30min，连续杀菌3天），加棉塞，置恒温箱中保温3~4天后，用显微镜检查。
*乳酸菌的检测法
:将预先干燥的碳酸钙0.05g与样品一同移入溶解的麦汁固体培养基中。混合均匀后，微浑浊即倒入已杀菌的双重皿中，放在38℃的恒温箱中培养3~4天。如有乳酸菌存在时，所产生的菌落周围是透明的环带。将上面的菌落，再加以碳酸钙平面培养。如再生成此种菌落，即将此菌落移植于500ml麦汁与10~15g碳酸钙的混合液中，在38℃的保温箱中进行培养。培养数日后，至液内已有二氧化碳存在时，过滤。滤液中含有乳酸钙，加浓硫酸，反应后乳酸即游离出来。滤去碳酸钙沉淀后，将滤液蒸发浓缩（以在50~60℃减压蒸发较好），在加硫酸使其呈酸性，用乙醚震荡，则乳酸溶于乙醚中，将乙醚蒸发，取少量残渣，以水溶解，用霍夫曼试剂（Uffelmannrcagent）[1%石炭酸溶液加稀薄氯化高铁（FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O）溶液数滴，溶液即呈青紫色]检查。如有乳酸存在，则紫色渐渐变成黄色，但酪酸等亦同样反应，应进一步检查，另取残渣少量，以水溶解，加入β-萘酚结晶少许，再加浓硫酸加热。加热时如含有乳酸即呈青色。
*醋酸菌的检测法
:醋酸菌在平面培养时，生成的菌落有不规则的边缘，呈青色有光泽，并有醋酸臭味。在啤酒培养基中培养时，最初1~2天内生成稍带青色的有光泽的柔滑皮膜，其后即带有细皱纹，干燥后成灰白色，并散发醋酸气味。以显微镜检查，呈单一或两个联结的杆状，有时呈长的连锁状或老废体；在24h新鲜培养基中，常有运动性。
*酪酸菌的检测法
:酪酸菌为厌氧菌，平面培养基不生菌落，在10°P以下的麦汁中密闭培养可以繁殖，产生酪酸的特臭。酪酸菌都有运动性，且有孢子。利用孢子在高温中短时间内不会死亡的特征，可以检查酪酸菌是否存在。
:将被检查的样品移入7%~10%麦汁培养基中，加热煮沸数分钟，使其他菌类死亡，然后加软木塞以隔绝空气，放在30℃恒温箱内培养48h，即产生酪酸的特有臭味（在培养中生成气体，软木塞容易被冲开，应该注意）。以显微镜检查，酪酸菌形状较大，有运动性，有孢子。细胞呈纺锤形，无孢子的细胞呈杆状，以碘液染色染成青紫色。
==野生酵母的检查==
===检查要点===
野生酵母可污染冷麦汁、发酵、贮酒各阶段，因此，啤酒厂对野生酵母需要进行经常性的检查。其检查点如下：
:#野生酵母主要污染种酵母，尽管接种时的污染率很低，但发酵完毕，回收的酵母中，野生酵母的污染率变大。因此，种酵母的检查是重点。
:#野生酵母在种酵母中所占比率甚小，但啤酒中的野生酵母比率较大，检查两者所含野生酵母的方法不同。
:#啤酒样品需要做野生酵母检查时，根据其所含细胞数多少确定是否需要做预处理。
:#在已经过无菌过滤或经巴氏灭菌的啤酒样品中，只含有极少数酵母细胞，需要先经过薄膜过滤，进行浓缩，然后在麦汁琼脂培养基上培养，由此形成的细胞，再进行野生酵母的检验。
:#若酒样中含有大量酵母细胞（如发酵完毕下酒时的酒样），则先经离心机分离沉淀物，加一点碱液进行镜检，并在如下不同培养基上进行培养。
::*麦汁培养基：所有酵母均可以生长。
::*麦汁+10mg/L放线菌酮：非酵母属的酵母菌株可以生长。
::*啤酒+糖（满瓶，无瓶颈空气存在）：只有微需氧的酵母可以生长，由此培养所得样品，进行麦汁琼脂培养基的平面培养，在以所得菌落进行野生酵母的检查。
===野生酵母的检验方法===
区别野生酵母和培养酵母的关键在于，区别两者的某些形态和生理上的特点。检验内容主要如下：
:#外观形态
::一般来说，只通过镜检形态，较难区分野生酵母和培养酵母，特别是酵母属的野生酵母。但对有些非酵母属的野生酵母，如毕赤酵母、圆酵母、假丝酵母、酒香酵母等，由于形态差别大，还是比较容易区分的。通过镜检，检验出野生酵母，这种污染往往已经是比较严重了，在生产中常会出现异常现象，如风味变异、酒液不澄清等。
:#抗热性能
::啤酒酿造中遇到的一些野生酵母，其灭死温度均较培养酵母高。将含有一定细胞数待检样品的悬浮液，先进性50℃、20min的加热处理，排除培养酵母。冷却后，摇动均匀，取1ml悬浮液进行固体平面培养，生存的细胞都是野生酵母，主要有圆酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母和一些易形成浑浊的酵母属野生酵母。
:#孢子形成试验
::野生酵母较培养酵母容易生成孢子，先按上述抗热性能试验，将待检样品进行处理，排除培养酵母。冷却后，取2ml待检悬浮液，移植至10ml麦汁中，在25℃、48h，然后取沉淀的酵母移植到醋酸钠琼脂培养基（醋酸钠培养基的组成：葡萄糖0.06%，蛋白胨0.25%，醋酸钠0.5%，琼脂2%，调节pH值到7.0）上，进行孢子形成试验，在25℃、48h内形成孢子者为野生酵母。利用此法，野生酵母可以在1/500000的低浓度下被检出。此方法有局限性，因为很多野生酵母如假丝酵母、圆酵母等并不形成孢子，但这些酵母在形态上还是比较容易区分的。
:#糖类发酵
::上面发酵啤酒酵母能发酵葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、1/3棉籽糖，但是不能发酵蜜二糖；下面发酵啤酒酵母则能全部发酵上述糖类；野生酵母大都不能全部发酵上述糖类。如果再采用一些培养酵母不能利用而野生酵母可以利用的糖类，如阿戊糖、甘露醇糖、鼠李糖、山梨糖等作为选择性培养基，一些酵母属的野生酵母和假丝酵母、圆酵母都可以检出。
:#选择性培养基鉴别法
::利用不同酵母在不同培养基上的生长情况进行鉴别，这是目前最常用且有效的方法。啤酒厂常用于检验野生酵母的选择性培养基有以下几种
::{| class="wikitable"
|-
| 培养基名称 || 活性成分 || 作用
|-
| 赖氨酸培养基（以赖氨酸为唯一氨源） || 盐酸赖氨酸 || 检出非酵母属的野生酵母
|-
| 放线菌酮培养基 || 2~4mg/L放线菌酮 || 作用同赖氨酸培养基，但放线菌酮浓度在0.2mg/L以下时培养酵母也能生长
|-
| 结晶紫培养基 || 20mg/L结晶紫 || 能检出赖氨酸培养基不能检出的大多数野生酵母
|-
| 史瓦兹培养基（Schwarz differential medium，简称S.D.M） || 品红亚硫酸盐混合物（0.3%~0.5%） || 应用于所有野生酵母
|-
| 林氏培养基（Lin's medium） || 品红亚硫酸盐+结晶紫 || 与赖氨酸培养基协同作用，检出非酵母属的野生酵母
|}
::*赖氨酸培养基
:::此法简单易行，很多野生酵母可以检出，但酵母属的野生酵母不能检出是其缺点。此类酵母是啤酒厂常遇到的野生酵母，容易形成浑浊。赖氨酸培养基的配方和制备方法如下：
:::*溶液A：硼酸0.1g，硫酸锌0.4g，钼酸铵0.02g，硫酸锰0.04g，硫酸亚铁0.25g，加水至1000ml。
:::*基础培养基B：葡萄糖50g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，氯化钙（熔融）0.2g，氯化钠0.1g，腺嘌呤0.002g，DL-蛋氨酸0.001g，L-组氨酸0.001g，DL-色氨酸0.001g，溶液A1ml，乳酸钾（50%）12g，琼脂20g，加水至1000ml，以乳酸菌调节pH值到5.0~5.2.
:::*赖氨酸溶液C：L-赖氨酸10g加水至1000ml。
:::*溶液D：肌醇2g，乳酸钙0.2g，盐酸硫胺素0.04g，吡哆醇0.04g，对氨基苯甲酸0.02g，核黄素0.02g，生物素0.0002g，叶酸0.0001g，加水至1000ml。
:::*上述溶液B、C、D，分别简写蒸汽灭菌30min，连续3天，取溶液B 89份、溶液C 10份在45℃~50℃下混合均匀。每100ml混合液可制备8套培养皿，在37℃下保温过夜备用。
:::*检查方法：将待检酵母试样，用无菌水离心洗涤3次，取0.2ml悬浮液，以上述培养基做划线平面培养，25℃保温，每天观察其生长情况，计算菌落生长数，即为野生酵母，并按原接种量换算每百万细胞内的野生酵母数。
::*放线菌酮培养基
:::培养基中添加2~4mg/L放线菌酮，就可抑制培养酵母，很多野生酵母，如毕赤酵母、圆酵母、酒香酵母等，可以检出。酵母属的野生酵母不能被检出。
::*结晶紫培养基
:::结晶紫培养基中含有20mg/L结晶紫，能抑制啤酒酵母生长，如巴西酵母、啤酒酵母椭圆变种和糖化酵母等均可以检出。
:::大多数赖氨酸培养基不能检出的酵母属野生酵母，用结晶紫培养基可以检出，而赖氨酸培养基可以检出的多数野生酵母用结晶紫培养基不能检出。此两种培养基结合运用，可以达到很好的互补检出效果。
::*史瓦兹培养基
:::啤酒酵母在此培养基内受到抑制，不生长或生长很慢，只形成不明显的菌落，而野生酵母的生长不受抑制，可以形成巨大菌落。从菌落的形态、大小和色泽可以检出某些野生酵母，如假丝酵母、汉逊酵母、糊精酵母和啤酒酵母椭圆变种等。
:::培养基的配方如下：
:::*基础培养基：麦汁浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，酵母浸膏0.3%，琼脂2.0%。
:::*品红亚硫酸混合物（0.3%~0.35%）：碱性品红4g，无水亚硫酸钠25g，糊精1g，在乳钵中混合研磨后，在干燥器中存放3天，然后置于密封的黑棕色瓶中备用。
:::*培养基的制备：将以上成分混合，加入需要量的蒸馏水，煮沸15min，冷却至45℃，将培养基倒入已灭菌的平面皿中，在室温下固化，然后在30℃保温贮存，过夜备用。
:::此培养基的效果随贮存时间延长而降低，在检查时，必须采用新制备的的培养基。
::*林氏培养基
:::啤酒酵母在此培养基内受到抑制，不易生长，而野生酵母则能形成明显的巨大菌落。有少数野生酵母在林氏培养基中不能检出，在赖氨酸培养基中可以检出。此两种培养基协同运用，可以达到良好的检出效果。
:::培养基的配方如下：
:::*基础培养基：麦芽浸膏0.2g，酵母浸膏0.4g，琼脂2.0g，蛋白胨0.2g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钾0.1g，氯化铵0.05g，蒸馏水100ml。
:::*品红亚硫酸盐混合物0.1g（处理方法同史瓦兹培养基）。
:::*结晶紫0.4~3.5mg/L。结晶紫原液的制备方法如下：含88%的结晶紫0.1136g，溶于0.5ml95%酒精内，用蒸馏水稀释成100ml，置2℃保存。使用时，将原液稀释成需要的浓度。
:::*培养基的制备：将上述成分悬浮在所需量的水中，加热煮沸；在0.1MPa压力下，加热15min，冷却，倒入培养皿中，此培养皿置5℃左右温度下静置24~48h备用。
:::应用：每一个培养皿中加入0.2~0.3ml含1×10<sup>6</sup>以下细胞数的接种体，使其均匀分布于培养基表面上，置25℃保温，观察4~6天后，培养基上形成的明显菌落为野生酵母。
:#免疫荧光法
::这是当前检出野生酵母灵敏度最高的方法，它不但可以检查出用其他方法不易检出的酵母属野生酵母，而且其检出灵敏度非常高，可以在百万个以上的培养酵母中检出个别的野生酵母。但此法需制备必需的抗血清，一般不作为常规方法使用。
==野生酵母的鉴定==
==霉菌的检查与鉴定==
:一般房屋空气中都有相当数量的霉菌孢子存在，较为常见的是根霉、毛霉、青霉和曲霉等。如用杀过菌的察氏培养基平板，开盖暴露于空气中，几分钟后即加盖进行培养（25℃~30℃）将会有霉菌生长。
:霉菌大部分在常温下生长，适宜温度为25~30℃，也有能耐35℃以上高温的。而有的则喜欢较低的温度。湿度是霉菌发芽的必需条件，限制湿度可以阻止霉菌生长，霉菌能在较广的ph范围生长，不过大部分喜欢酸性。霉菌是好氧性微生物，故啤酒厂一般不把霉菌看成病害微生物。因为缺氧，它们不宜在啤酒内生长，然而许多霉菌能生长在啤酒表面。霉菌污染虽然没有野生酵母、细菌污染那样严重，但是也应该引起注意。
:啤酒厂中超市的枪毙、地板、天花板、脏桶、空桶以及暴露在空气里的酵母泥上面，还有一切沾有啤酒残渍污染的地方，均能滋生霉菌。日常，要注意整个啤酒厂的清洁卫生工作，检查一切不干净的地面、死角，随时修理漏酒管道和阀门，被啤酒玷污过的地板和墙壁、木制工具和木质发酵容器要经常洗刷，工具用后浸入灭菌水中，必要时对经常染菌的天花板、墙壁等可用防霉涂料，以上措施对防治霉菌和细菌污染是极为有效的。
=生产过程中微生物的检查与控制=
要防止杂菌的污染，平时需要进行经常性的微生物检查和严格的清洁灭菌管理。防止病害微生物的污染，主要是对微生物的控制，在实际生活中，每天均进行详尽的检验是不可能的，可定期在重点部位取样检查，有些项目可作为常规控制，经常检查分析，并对啤酒厂经常检出的杂菌有所了解，发现污染，即进行详尽检查，找出污染源，并设法处理。检验不出有污染，说明工厂的清洁卫生工作和酵母条件较令人满意。
==空气的细菌检查==
前已述及，在啤酒生产过程中，无论是传统生产工艺还是现代化发酵啤酒生产工艺，冷却麦汁中发酵初始一般要求含氧量在6~10mg/L。因此，在冷却麦汁过程中需要通入“无菌空气”，特别是传统发酵生产，开口发酵需要保持室内空气无菌条件。啤酒厂的污染，空气是主要来源之一，因此，了解空气中的细菌数是有意义的，应对无菌室、压缩空气、发酵室等经常进行检查。
空气中的细菌数检查，最简单的方法是利用平面捕捉法，以求其在一定时间内落于培养基表面的细菌数。方法为：先将约10ml的麦汁固体培养基熔化，以无菌操作倒入双重皿内，摇动使其均匀凝固后，放在要检查的场所中央。将门关闭，停止空气流动，将双重皿的盖打开，放置5min，而后将盖子盖好，并用纸包裹，置于25℃恒温箱中3~4天。取出，检查酵母、霉菌、细菌等繁殖的菌落，分别予以记录。
检查压缩空气污染很重要，但目前尚无好的方法。现有的方法较复杂，首先要对空气定量，要配有流量计，然后用生理盐水或0.5%蛋白胨溶液吸附，再用平板法计数。此法工厂不乐于使用，简单测定可直接用培养皿检查：
:先以酒精将压缩空气排气口杀菌，再以火焰充分杀菌。将排出的压缩空气排放半分钟，用盛有固体培养基的双重皿捕捉1min，加盖，并用纸包裹，置于25℃恒温箱中培养3~4h。取出，检查菌数、细菌和野生酵母的菌落，并分别予以记录。
==啤酒生产中重点部位的取样和检验==
===发酵阶段发酵工段===在发酵工段中，麦汁、种酵母受杂菌感染的机会较多，若洗涤发酵容器和管路不彻底，其最后的洗涤水中也会存在杂菌。均需要经常进行病害微生物的检验。 #麦汁:*取样：冷麦汁出口处，在麦汁开始流出时和流出30min后取样。检查内容如下：::#稳定性的测定:::在无菌条件下，迅速取麦汁样品，装入无菌试管中，并立即用棉花塞将试管口塞好。将试管放置于室温下，记下麦汁开始发生变化的时间，麦汁的生物稳定性指标规定如下：::::麦汁开始发生变化时间＜24h，不好；::::麦汁开始发生变化时间＜36h，可以；::::麦汁开始发生变化时间＜60h，良好；::::麦汁开始发生变化时间≥90h，优良；:::当麦汁发生变化以后必须对生产的菌膜或浑浊沉淀物进行镜检以确定引起这些变化的微生物的基本种类。 ::#总污染度:::测出1ml麦汁中微生物的总数，就可以判断麦汁的污染度。此种分析每周进行一次同时单独地计算细菌、霉菌和野生酵母的数量，最好从两次不同的稀释中取其均值。结果表示方法为：::::总污染度＜10个/ml，麦汁为良好；::::总污染度＞1000个/ml，麦汁为不好；:::若30min后取样的总污染度仍然很高，说明设备和管路的灭菌工作有问题，应该进行彻底清洁灭菌。 ::#大肠菌群的检查:::麦汁中最易感染大肠菌群，可用Meconkey培养基进行检查。 #种酵母:*取样：用无菌吸管插入酵母槽底部取样，注入无菌粗试管中备用。检验内容如下：::#酵母的镜检:::镜检出不合要求酵母，此种酵母将会影响啤酒发酵，不得应用于生产。:::#形态。正常的底面啤酒酵母细胞应为卵圆形，其大小为6~10μm，细胞质较稠密且均匀。若出现较大液泡和具有颗粒状细胞质的细胞以及不发生芽殖的细胞，说明酵母变老，在这种情况下，酵母在使用之前必须复壮。:::#酵母细胞中肝糖的含量。根据酵母细胞中肝糖的含量就可以了解酵母的发酵能力。测定肝糖的含量，可用Lugol碘液染色，经过5~6min后，放在显微镜下观察。它与碘化合时呈棕褐色。当不存在肝糖时，细胞染成黄色。计算10个视野内肝糖细胞的百分数。在正常酵母中，70%~75%的细胞都含有肝糖。含肝糖的细胞数量少，则说明酵母细胞衰老或营养缺乏。::::采用含肝糖少的酵母发酵，可延长主发酵的周期。酵母细胞中肝糖的含量因酵母的贮养条件不同而迅速变化。酵母在水中长期贮养，以及高温度都能促使其中肝糖的含量大大减少。肝糖含量低的种酵母在使用之前亦应复壮。:::#丝酵母细胞的测定。死细胞含量是种酵母的重要质量指标。测定死细胞数的方法可用次甲基兰稀溶液进行染色后镜检。新培养酵母染色细胞极少，一般要求在1%以下。如果死细胞超过10%则会造成一系列不正常现象：主发酵缓慢、萎靡，刺激了球菌的繁殖，啤酒中产生酵母自溶味。:::#杂菌的含量。为了使蛋白质溶解，可加入一滴10%的碱液，取样在显微镜下镜检，每次镜检不少于25个视野，每个视野内应该有大约40个酵母细胞。这样，就可以观察1000个酵母细胞，并计算出其中野生酵母和细菌（通常为乳酸菌）的含量。细菌含量不超过1%，野生酵母不超过0.5%的种酵母可以认为是合格的。根据在25个视野内杂菌的含量，检定酵母质量的大致标准如下：:::::杂菌数量0~2个，种酵母评价为优良；:::::杂菌数量2~4个，种酵母评价为良好；:::::杂菌数量4~10个，种酵母评价为可以；:::::杂菌数量10~50个，种酵母评价为不好； ::#总污染度:::按上述选择性培养基（放线菌酮培养基）的方法，进行野生酵母和细菌的检查，如总污染度超过0.1%，则需要更换酵母并进行彻底灭菌。 #嫩啤酒:发酵完毕下酒时，从发酵罐中取出试样，进行离心分离，将液体倒掉，其沉淀物加一滴碱液进行镜检，当发现有杂菌存在时，进行麦汁（加酒花及10μg/g放线菌酮）琼脂的平面培养，求其杂菌总数。如果已经掌握污染是属于哪一种杂菌时，检验范围可以缩小到只针对这一种杂菌的检验，其效果较测总污染度更好一些。 #洗涤水:检查洗涤水的目的是为了检查设备洗涤的质量。设备洗涤后，从最后一次洗涤水中取样，检查其菌体繁殖能力及细胞数。一般重点检查冷却器、酵母槽、发酵罐、橡皮管、麦汁管路和啤酒管路的洗涤用水。:#镜检：::取最后一次洗涤水5~10ml，以1500~2000r/min离心分离10min。将上层液体倾去，去沉淀进行镜检，在不少于10个视野内观察，当洗涤质量良好时，其中不应有5个以上的微生物细胞，如果每个视野中都有微生物，则证明设备洗的不干净，必须重新进行清洗。 :#总菌体繁殖力的测定：::从最后一次洗涤水的试样中取0.1~1ml，进行平板稀释培养，当洗涤质量良好时，洗涤用水中微生物的总数不应该与洗涤用水中的微生物有很大差别。 ===贮酒阶段贮酒工段===啤酒在贮酒罐中受感染的机会较少，但是每天进行微生物检查仍然是必要的。倘若贮酒罐洗涤不干净、橡皮管和啤酒管道的卫生欠佳、贮酒罐酒装的不满或助滤剂处理不当，都会使啤酒在最后的生产阶段受到污染。 #贮藏啤酒及过滤啤酒的检验::取样地点：滤酒前及滤酒后的酒样。::检验内容：滤酒前酒样的检验同嫩啤酒；滤酒后酒样需先经薄膜过滤浓缩样品，然后进行平面培养。 #洗涤用水的检验::同发酵工段用水的检验。 #滤饼的检验::由于成品啤酒的生物稳定性与滤饼的洗涤质量关系很大，因此必须系统地检查滤饼的洁净程度，并且每周不得少于一次，测定其在麦汁中的生物稳定性及其总污染度。（略） #灌装工段:装酒容器的洁净程度，对于啤酒的生物稳定性有重大意义，应该经常进行微生物检验。:#酒瓶::取5个洗过的酒瓶，把瓶中残存的水倒入一个无菌瓶中，将此水进行稀释，进行固体平面培养，经过48h培养后鉴定洗瓶的质量，如果1ml洗涤水中的微生物与1ml用于洗涤用水中的微生物数量没有多大区别，则说明瓶子已经洗干净。 ::另一种方法是测定洗过的酒瓶中的微生物总数。即向5~10个西帝国的酒瓶中，依次倒入20ml无菌水，并用力震荡5min，将此水接到麦汁琼脂培养皿中，在25~28℃下培养48h，最后折算成一平中所含的微生物总数。 :#瓶盖与瓶垫::为了测定瓶垫的清洁度，从浸泡瓶垫的水中取样300~500ml倒入无菌玻璃瓶中，并培养检查细菌总数和是否存在大肠菌群。::瓶盖直接用无菌镊子从工作地点取10个，放入无菌的广口瓶中，注入10ml无菌水，摇动5min，取此水进行平面培养，并折算每个瓶盖上的微生物总数。每个瓶塞上的微生物数量不超过100个。 :#啤酒::取样地点：进入装酒机前后的酒样。::检验内容：同过滤啤酒。 :#洗涤用水的检验。同发酵工段用水的检验。
==啤酒厂主要生产工序微生物控制指标==
[[文件:啤酒厂主要生产工序微生物控制的参考指标.jpg]]
=选择性培养基的应用=
