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*普通营养琼脂培养基：按本标准A2.1制备。
*试剂
:*C2.2.1. 稀释液：含1%蛋白胨的0.03mol/L PBS(pH7.2～7.4)。
:*灭菌蒸馏水。
:*中和剂：按本标准附录A选择。
:*阳性对照以洗脱液代替消毒液，同时按C4.1.2～C4.1.5进行。
:*按不同稀释度推算出每个样本存活菌数(cfu/mL)，按式(C1)计算杀灭率。
:*C4.1.8. 试验重复5次。
*载体定量试验
==结果判定==
*次试验的杀灭率均≥995次试验的杀灭率均≥99.9%判为消毒合格。
*对枯草杆菌黑色变种芽胞5次试验均全部杀灭判为消毒合格。
==培养基与试剂==
*普通营养琼脂培养基，按本标准A2.1制备。
*试剂：
:*稀释液：同C2.2.1。
:*灭菌蒸馏水。
:*中和剂：按本标准附录A进行选择。
:*0.03mol/L磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)(简称PBS)。
:*洗脱液：含1%蛋白胨，0.1%吐温80的生理盐水。
:*小牛血清加入菌悬液中，使其最终浓度为10%。
==器材==
同本标准附录C中器材。
==试验方法==
*实验前预先将菌液进行活菌计数，用稀释液稀释，加入小牛血清，使其最终含血清量为10%，含菌数为5×105～5×106cfu/mL，以此作为试验菌悬液。
*以下步骤同本标准C4.1.2～C4.1.8。
==结果判定==
*5次试验的杀灭率均大于99.9%所需最低浓度和最短时间，判为该消毒剂在有机物存在下，可以达到消毒的有效浓度和时间。
*此有效浓度和时间与定量消毒试验达到消毒的有效浓度和时间相同或相近，判为有机物对消毒剂杀菌作用无明显影响。达到消毒最低有效浓度增加一倍以上或最短作用时间延长一倍以上者可视为有明显影响。
=附录E=
乙型肝炎表面抗原破坏试验
==内容提要==
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)破坏试验是以HBsAg的抗原活性为间接标志，评价消毒因子对乙型肝炎病毒(HBV)灭活能力的试验方法。
适用于评价化学消毒剂、紫外线对HBV的消毒效果。
==试剂==
*小牛血清(56℃，30min灭活)
:*0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2～7.4)。
:*纯化HBsAg(1.0mg/mL)。
:*固相放射免疫分析法试剂，要求特异性100%，精密性CV≤15%，灵敏度≤1.0ng/mL，线性r＞0.95。
:*酶联免疫吸附法试剂，要求特异性100%，精密性CV≤15%，灵敏度≤3.2ng/mL，线性r＞0.95。
==器材==
*吸量器：包括试管、吸管(0.1，1.0，5.0和10.0mL4种)和微量进样器(100.0μL)。
*载体(直径1.5cm大小的不锈钢片)。
*免疫计数仪。
*酶联免疫测定仪。
*低温冰箱(—30℃～—70℃)。
==HBsAg悬液的配制==
*取0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)9.4mL加入小牛血清0.6mL，配成含6%小牛血清的悬液。再取该PBS 9.0mL，加入浓度为1.0mg/mL的纯化HBsAg悬液1.0mL，使成含5.4%小牛血清，HBsAg浓度为100μg/mL的试验用HBsAg悬液。
*将试验用HBsAg悬液1.0mL盛装入容量为1.5mL的玻璃安瓿中，封口，放-30℃～-70℃冰箱保存备用。保存期为三个月。
==HBsAg的检测方法==
*固相放射免疫分析法(SPRIA)。
*酶联免疫吸附法(ELISA)。
==中和剂选择==
在测定消毒剂对HBsAg的破坏效果时，应先选出适宜的中和剂及其使用浓度，再进行破坏试验。
所用中和剂：a.应能有效而及时中止消毒剂的残余作用；b.中和剂及其与消毒剂的中和产物对HBsAg的抗原活性没有影响，亦不影响检测方法对HBsAg检出的灵敏度。
*将消毒剂用无菌蒸馏水配成不同浓度，取1.2mL消毒液与0.3mLHBsAg悬液混匀，置20±2℃水浴条件下，作用10min，测定该消毒剂10min抑制或破坏HBsAg抗原性的最低有效浓度。
*取消毒剂10min抑制或破坏HBsAg抗原性的最低有效浓度与待选中和剂进行试验，试验可按下列组别进行：a.消毒液0.9mL+HBsAg悬液0.1mL；b.消毒液0.4mL+HBsAg悬液0.1mL作用10min后+含20%小牛血清的中和剂0.5mL；c.先取含20%小牛血清的中和剂1mL与消毒液1mL，混匀，作用10～30min，制成中和产物溶液，再行试验。中和产物溶液0.9mL+HBsAg悬液0.1mL；d.含10%小牛血清的PBS0.9mL+HBsAg悬液0.1mL；e.含10%小牛血清的中和剂0.9mL+HBsAg悬液0.1mL；f.中和产物溶液0.9mL+PBs0.1mL。经检测只有在c、d、e组HBsAg活性的测定值相近(相差10%以下)并都明显多于b组，a组HBsAg活性不能检出或检出活性明显少于b组，f组阴性对照正常，方可证明所选中和剂及其使用剂量是适宜的。
*进行消毒试验时，依据消毒剂与中和剂等当量中和原则，适当调整中和剂的用量。再次按E6.2步骤测定中和效果后，方可进行抗原性破坏试验。
==破坏试验方法==
*悬液法
:悬液法指将HBsAg在悬液中与消毒剂相互作用并进行抗原性破坏效果观察的试验方法。
:*HBsAg悬液的浓度为检测试剂灵敏度的104倍。如检测试剂的灵敏度为1ng/mL，HBsAg的浓度应为10μg/mL。
:*取含5%小牛血清的PBS2.7mL加到含0.3mL浓度为100μg/mL的HBsAg悬液中，混匀。
:*取小牛血清20mL加到含80mL灭菌的中和剂溶液中，混匀。
:*破坏试验：将预定消毒液浓度1.25倍的消毒液与HBsAg悬液按4∶1比例混合，混合液容量不少于1.5mL。然后置20±2℃水浴条件下，作用达规定时间，即刻取0.3mL混合液与等体积含20%小牛血清的中和剂混匀，作用10～30min，取样测定残留HBsAg的活性，每一样本平行测定2份，每份0.1mL，取其平均值，判定破坏效果。每种消毒剂观察3个浓度，每一浓度观察4个作用时间。试验重复5次。
:*阳性对照：取含20%小牛血清的中和剂1mL，加到含1mL试验用消毒液的试管中混匀，作用10～30min，制成中和产物溶液。取该中和产物溶液0.9mL加入试验浓度的HBsAg悬液0.1mL取样检测，每一样本检测3份，每份0.1mL，取其平均值为阳性对照值。
:*阴性对照：取含20%小牛血清的中和剂1mL加到含1mL试验用消毒液的试管中，混匀，作用10～30min，取样检测，每一样本检测3份，每份0.1mL取其平均值为阴性对照值。
:应注意阴性对照不能用试剂盒的阴性对照样本。
*载体法
:载体法指将在载体表面的HBsAg与消毒因子相互作用，并进行抗原性破坏效果观察的试验方法。
:*HBsAg载体的制备
::*载体为直径1.5cm大小的不锈钢片，经洗涤剂煮沸洗涤脱脂、压力蒸汽灭菌备用。
::*HBsAg悬液的浓度为检测方法灵敏度的5×104倍。如灵敏度为1ng/mL，HBsAg的浓度应为50μg/mL。
::*HBsAg的污染方法为滴染法。滴染时，将灭菌载体平铺于无菌平皿内，用微量进样器吸取HBsAg悬液，滴注于载体中央，每个载体20μL。然后用L型白金丝将悬液涂布均匀，放37℃培养箱40～60min，待悬液干燥后进行抗原性破坏试验。
:*抗原性破坏试验
::取污染HBsAg的载体，平放于无菌平皿内，用吸管吸取预定浓度的消毒液50μL，滴注于载体中央，迅即涂匀，使整个载体均匀受药。每2片一组，置20±2℃水浴中，作用至规定时间后，用无菌镊子将载体移入含1.0mL10%小牛血清的中和剂试管中。作用10～30min，敲打振荡200次，取样检测残留HB-sAg的活性，每一样本取样2份，每份0.1mL，取其平均值，判定抗原性的破坏效果。每种消毒剂观察3个浓度，每个浓度观察4个作用时间。
试验重复5次。
::在观察紫外线破坏HBsAg的效果时，将污染载体直接置作用因子下，作用至规定剂量后将载体移入含1.0mL10%小牛血清PBS的试管中，敲打振荡200次，取样检测残留HBsAg活性，每一样本取样2份，每份0.1mL，取其均值，判定破坏效果。试验重复5次。
:*阳性对照
::在观察消毒剂破坏HBsAg效果时，取50μL试验用消毒液加到含1.0mL10%小牛血清中和剂的试管中，作用10～30min，制成中和产物溶液。取该中和产物溶液1.0mL加到大试管中，然后将滴染HB-sAg的载体移入，敲打振荡200次，每一样本检测3份，每份0.1mL，取其平均值为阳性对照值。
::在观察紫外线破坏HBsAg效果时，将污染HBsAg的载体直接移入含1.0mL10%小牛血清的PBS(PH7.2～7.4)的试管中，敲打振荡200次，每一样本检测3份，每份0.1mL，取其平均值为阳性对照值。
:*阴性对照
::在观察消毒剂破坏HBsAg效果时，取50μL消毒液加到含1mL 10%小牛血清中和剂试管中，作用10～30min，取样检测，每一样本检测3份，每份0.1mL。取其平均值为阴性对照值。
::在观察紫外线破坏HBsAg时，阴性对照则为含10%小牛血清的PBS(pH7.2～7.4)。每一样本检测3份，每份0.1mL，取其平均值为阴性对照值。
::应注意阴性对照不能用试剂盒的阴性对照样本。
==破坏效果判定==
以S/N＜2.1作为HBsAg抗原性破坏合格标准。其中S是消毒因子作用后被检样品或阳性对照样品平均每分钟脉冲数(cpm)值或光密度(OD)值。N是试验中阴性对照样品平均cpm值或OD值。
